Hallo. Dies ist also ein kleines RNA-Nordprotokoll. Es ist ein Derivat des Protokolls, das ursprünglich von Dr.Rashid Akbergenov optimiert wurde.
Bei dieser Methode kann man kleine RNAs von 20-24 Nukleotid in der Länge, sehr präzise und mit sehr hoher Auflösung erkennen. Das Protokoll ist im Grunde eine modifizierte Form der traditionellen Nordanalyse, aber hier ist der Acrylamidanteil ziemlich hoch, er liegt bei 15 Prozent. Dieser Norden kann zum Nachweis bereits bekannter kleiner RNA, entweder Mikro-RNA oder anderer kleiner RNA verwendet werden, wenn die Sequenz bekannt ist, oder es kann zur Bestätigung der Fülle kleiner RNA verwendet werden, die aus Sequenzierungsdatensätzen der nächsten Generation stammt.
Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass man nicht nur die Mikro-RNA-Fülle betrachten kann, sondern auch die Fülle von Vorläufern, z.B. Mikro-RNAs können einen Vorläufer auslassen, der etwa 30 ist, um ein paar hundert Nukleotid lang zu sein, dies kann auch gleichzeitig erkannt werden, zusammen mit der Mikro-RNA. Das Protokoll ist sehr einfach, sehr geradlinig, aber man muss sehr vorsichtig sein, während man einige kritische Schritte ausführt, die am Ende dieses Protokolls aufgeführt sind. Zur Herstellung der 10 ml Gelmischung 4,8 g Harnstoff, 3,75 ml 40%Acrylamidlösung und 1 ml frisch zubereitete 10X TBE, pH 8,2 hinzufügen und die Lösung vorsichtig mischen.
Harnstoff vollständig auflösen, indem man die Mischung in einem Wasserbad erhitzt, bis die Lösung klar aussieht. Machen Sie das Volumen auf 10 ml, mit sterilem MilliQ-Wasser und kühlen Sie die Gelmischung auf Raumtemperatur. Waschen Sie das benötigte Gerät mit Reinigungsmittel, schrubben Sie sie vorsichtig, um Reste VonBE und Acrylamid zu entfernen.
Spülen Sie sie weiter mit MilliQ-Wasser ab und lassen Sie es trocknen. Montieren Sie die Glasplatte zusammen, stellen Sie sicher, dass beide auf dem gleichen Niveau sind. Legen Sie sie fest auf den Schwamm.
Fügen Sie 8 Mikroliter TEMED und 80 Mikroliter 10% frisch zubereiteten APS in die Gelmischung. Mischen und gießen Sie die Gelmischung sanft auf die montierten Platten. Stellen Sie sicher, dass das Gel nicht austritt.
Legen Sie den Kamm vorsichtig. Lassen Sie das Gel ca. 45 Minuten polymerisieren. Entfernen Sie nach der Polymerisation des Gels die Glasplatten aus der Baugruppe.
Waschen Sie die Glasplatten mit MilliQ-Wasser. Und legen Sie sie in die laufende Kassette. Legen Sie die lauflaufende Kassette in den Tank.
Frisch zubereitet 1X TBE, pH 8,2 gießen. Entfernen Sie den Kamm vorsichtig. Waschen Sie die Brunnen des Gels gründlich, indem Sie den Puffer pipetieren.
Dieser Schritt entfernt Harnstoffausscheidungen aus dem Brunnen und erleichtert die RNA, gleichmäßig über das Gel zu laufen. Schließen Sie den Deckel des Geräts und führen Sie das leere Gel 30 Minuten lang bei 80 Volt vor, um pufferleckage zu überprüfen. Zur Herstellung von 10 ml Ladefarbstoff 5 mg Bromphenolblau, 5 mg Xylolcyanol wiegen und 10 ml deioinisiertes Formamid hinzufügen und gut vermischen.
Aliquot den Farbstoff und speichern bei 4 Grad für die weitere Verwendung. Aliquot 10 Mikrogramm gesamter RNA in sterile 1,5 ml-Röhren. Stellen Sie sicher, dass die Qualität der RNA, d.h.
das Verhältnis 260:230 ist größer oder näher an zwei. Legen Sie das Rohr in eine SpeedVac und Vakuum trocknen Sie die Proben. Die getrockneten RNA-Proben in 8 Mikroliter Ladefarbstoff wieder aufhängen.
Die Proben bei 98 Grad zwei Minuten erhitzen. Kühlen Sie sie für eine Minute bei Raumtemperatur. Wirbeln Sie die gekühlten RNA-Proben, um eine ordnungsgemäße Wiedersuspension im Ladefarbstoff zu gewährleisten.
Drehen Sie die Rohre. Wiederholen Sie die Schritte des Erhitzens, Kühlens und Wirbels dreimal, um frei fließende RNA zu erhalten. Beenden Sie die Vorlauf des Gels.
Waschen Sie die Brunnen gründlich, vor dem Verladen der Probe, um Ablagerungen des Harnstoffs in den Brunnen zu entfernen. Erhitzen Sie die wieder suspendierten RNA-Proben bei 98 Grad für eine Minute. Die Proben mit Kapillarspitzen heiß in die Brunnen laden.
Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen. Komplette Beladung aller Proben und Montage des Deckels. Führen Sie das Gel bei 80 Volt für drei Stunden oder bis das Bromphenol blau vollständig läuft.
Verwenden Sie positiv geladene Nylonmembran für den Transfer. Schneiden Sie es auf die Abmessungen der Glasplatte. Beschriften Sie die Membran in der rechten oberen Ecke.
Legen Sie die Membran vorsichtig auf die Oberfläche des sterilen MilliQ-Wassers und stellen Sie sicher, dass sie die Etikettenseite nach unten mit Blick auf die Wasseroberfläche aufstellt. Nehmen Sie ein sauberes Tablett und bereiten Gel-Sandwich für Elektro-Transfer. Legen Sie die graue Seite der Kassette nach unten.
Gießen Sie 1X TBE leicht über dem Niveau der Kassette. Das Faserpad in 1X TBE vorbefeuchten und drücken, um Luftblasen zu entfernen. Schneiden Sie zwei Stücke Blotpapier auf die Größe der Faserpad.
Ein Stück Blotting-Papier in 1X TBE vorbefeuchten und über das Faserpad legen. Entfernen Sie Luftblasen, indem Sie eine Kunststoffpipette über das Papier rollen. Ein weiteres Stück Blotting-Papier in 1X TBE vorbefeuchten und über die Kassette legen.
Überrollen, um Luftblasen zu entfernen. Jetzt ist das Sandwich-Setup bereit für den Elektrotransfer. Nach Abschluss der Elektrophorese den Lauf stoppen und den Deckel aus dem Gerät entfernen.
Entfernen Sie die laufende Kassette aus dem Setup. Nehmen Sie die Glasplatten aus der laufenden Kassette heraus. Entfernen Sie das Gel vorsichtig aus der Baugruppe.
Legen Sie es über das Blotting-Papier, so dass die erste geladene RNA-Probe zu Ihrer Rechten ist. Tauchen Sie die vorgetränkte Membran vorsichtig in 1X TBE und legen Sie sie über das Gel, mit Blick auf die beschriftete Seite nach unten. Lassen Sie die Membran und das Gel nicht trocknen.
Rollen Sie vorsichtig über, um Luftblase zu entfernen. Tauchen Sie ein Stück Blotpapier in 1X TBE und legen Sie es über die Membran. Entfernen Sie Luftblasen.
Legen Sie ein weiteres Stück Blotting-Papier und entfernen Sie die Luftblasen. Vervollständigen Sie das Sandwich, indem Sie das Faserpad über die Baugruppe legen. Schließen Sie die Kassette fest.
Legen Sie die Trans-Blot-Kassette in das Modul. Füllen Sie den Tank mit 1X TBE, pH 8,2, bis zur Blotting-Marke. Schließen Sie den Deckel des Geräts und übertragen Sie bei 10 Volt über Nacht bei 4 Grad oder in einem kalten Raum.
Halten Sie den UV-Kreuzlinker bereit und stellen Sie ihn kurz vor Abschluss des Elektrotransfers auf 1200 ein. Entfernen Sie nach Abschluss der Übertragung die Kassette aus dem Modul. Legen Sie die feuchte Membran auf ein A4-Blatt und platzieren Sie die markierte Seite nach oben.
Kreuzen Sie die RNA mit der Membran durch Bestrahlung mit 254 Nanometer UV-Licht bei 120 Milli Joule. Der vernetzte Fleck kann bei vier Grad gelagert oder zur Hybridisierung verwendet werden. Entwerfen Sie eine Sonde, die völlig komplementär zu der kleinen RNA ist, die nachgewiesen werden muss.
Beenden Sie die Sonde am fünf Hauptende mit PNK-Enzym und kombinieren Sie die Komponenten wie gezeigt. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 37 Grad für 30 Minuten. Nach 30 Minuten Inkubation verwenden Sie G-25-Säulen, um unbeschriftete Sonden vom Reaktionsgemisch zu trennen.
Für eine verbesserte Kennzeichnung der Sonde bereiten Sie die G-25-Säule vor dem Gebrauch vor. Legen Sie den Fleck, RNA-Seite nach oben, in eine Hybridisierungsflasche. Mischen Sie den Hybridisierungspuffer vor der Verwendung kräftig.
Fügen Sie 10 ml Hybridisierungspuffer innen und legen Sie die Hybridisierungsflasche in den Hybridisierungsofen, halten Sie bei 35 Grad mit Rotation. Führen Sie die Vorhybridisierung für 20 bis 30 Minuten durch. Nach der Vorhybridisierung die Flasche aus dem Ofen nehmen.
Fügen Sie den beschrifteten Prüfpunkt vorsichtig in den Hybridisierungspuffer ein. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen entstehen. Inkubieren Sie den Fleck im Ofen bei 35 Grad mit Rotation für 12 Stunden.
Entfernen Sie nach der Hybridisierung den Hybridisierungspuffer aus der Flasche. Führen Sie eine schnelle Wäsche der Flecken, mit Waschpuffer-I. Dieser Schritt wird ausgeführt, um überschüssige Hybridisierungslösung aus den Blots zu entfernen.
Die Flecken 30 Minuten lang mit Waschpuffer-I bei 35 Grad weiter bebrüten. Führen Sie eine weitere Wäsche mit Puffer-II bei 35 Grad für 30 Minuten. Nach dem Waschen des Flecks, legen Sie es in eine Hybridisierungsabdeckung, entfernen Sie überschüssigepuffer und versiegeln Sie es.
Legen Sie es in eine Kassette und setzen Sie es 12 Stunden lang einem strahlungsfreien Phospho-Imager-Bildschirm aus. Erkennen Sie das Hybridisierungssignal mit dem biomolekularen Imager des Taifuns und analysieren Sie die Ergebnisse mit der ImageJ-Software. Führen Sie für die Hybridisierung des Blots mit anderen Sonden Strippingschritte durch, wie dargestellt.
Mit dieser Technik kann man die Fülle der Mikro-RNA abschätzen, sowie ihre Länge. Aus diesem Bild kann die Expression von Micro-RNA 397 in allen Proben nachgewiesen werden. In diesem Blot beträgt die Fülle der Stichprobe eine etwa 5 Lesevorgänge pro Million, wie pro Sequenzierungsdaten der nächsten Generation, was darauf hindeutet, dass unsere Technik auch weniger reichliche Mikro-RNAs erkennen kann.
Darüber hinaus kann man mit Hilfe der ImageJ-Quantifizierungssoftware die Expression von Micro 397 unter den Proben quantifizieren. Hier haben wir U6 und micro RNA 168 als Ladesteuerungen verwendet. Ich werde über einige entscheidende Schritte sprechen, die bei der Durchführung des Experiments berücksichtigt werden müssen.
Achten Sie darauf, gute RNA-Qualität für die Probenvorbereitung zu verwenden. Vermeiden Sie beim Vakuumtrocknen der Proben eine Übertrocknung. Eine Erneutsuspension der RNA im Ladefarbstoff ist entscheidend.
Stellen Sie sicher, dass Sie eine frei fließende Probe vorbereiten. Beim Beladen des Gels ist Vorsicht geboten. Die Brunnen des Gels müssen gewaschen und die Probe in einer geraden Linie in die Brunnen geladen werden.
Während der Elektroübertragung ist die Verteilung der Membran in Wasser, kurz vor dem Eintauchen in 1X TBE, wichtig, es verbessert den Transfer. Die Hybridisierung des Blots muss bei 35 Grad erfolgen. Halten Sie die Temperatur des Hybridisierungsofens aufrecht.
Für die wiederholte Verwendung der Flecken müssen Membranen bei 4 Grad gelagert werden. Sie sollten in 2X SSE feucht gehalten werden. Im Gegensatz zu anderen PCR-basierten Methoden stellt diese Methode die Quantifizierung des Ausdrucks sowie die Bestimmung der Größe der Mikro-RNAs sicher.
