안녕. 그래서 이것은 작은 RNA 북부 프로토콜입니다. 그것은 원래 박사 라시드 Akbergenov에 의해 최적화 된 프로토콜의 파생.
이 방법에서, 하나는 길이20-24 뉴클레오티드 사이의 작은 RNA의 어디에서나 검출할 수 있습니다, 아주 정밀하고 매우 높은 해상도. 프로토콜은 기본적으로 전통적인 북부 분석의 수정 된 형태이지만, 여기에 아크릴아미드의 비율은 매우 높다, 그것은 15 %. 이 북부는 이미 알려진 작은 RNA, 마이크로 RNA 또는 다른 작은 RNA 세트를 검출하는 데 사용될 수 있으며, 시퀀스가 알려지거나 차세대 시퀀싱 데이터 세트에서 나오는 작은 RNA의 풍부성을 확인하는 데 사용될 수 있다.
이 방법의 장점은, 마이크로 RNA 풍부뿐만 아니라 전구체의 풍부도 볼 수 없다는 것입니다, 예를 들어 마이크로 RNA는 약 30 내지 수백 뉴클레오티드 길이일 수 있는 전구체를 남길 수 있고, 이것은 또한 마이크로 RNA와 함께 동시에 검출될 수 있다. 프로토콜은 매우 간단하고 매우 직선적이지만 이 프로토콜의 끝에 나열된 몇 가지 중요한 단계를 수행하는 동안 매우 신중해야 합니다. 10mL 젤 믹스를 준비하기 위해 4.8 그램의 우레아, 40 % 아크릴아미드 용액의 3.75 mL, 갓 준비된 10X TBE, pH 8.2를 넣고 부드럽게 혼합하십시오.
용액이 명확해 보일 때까지 수조에 혼합물을 가열하여 우레아를 완전히 녹입니다. 멸균 밀리Q 물을 사용하여 10mL로 볼륨을 구성하고 실온으로 젤 믹스를 냉각시하십시오. 필요한 장치를 세제로 씻고 부드럽게 문질러 서완 TBE와 아크릴아미드를 제거하십시오.
또한 밀리Q 물로 헹구고 건조시키십시오. 유리 판을 함께 조립하여 둘 다 동일한 레벨에 있는지 확인합니다. 스폰지에 단단히 놓습니다.
8 마이크로 리터의 TEMED와 80 마이크로 리터의 10 % 갓 준비 된 APS를 젤 믹스에 추가합니다. 젤 믹스를 조립된 접시에 부드럽게 섞고 붓습니다. 젤이 누출되지 않도록 하십시오.
빗을 조심스럽게 놓습니다. 젤이 약 45분 동안 중합되도록 허용합니다. 젤의 중합 후, 어셈블리에서 유리 판을 제거합니다.
유리 판을 MilliQ 물로 씻으시면 됩니다. 그리고 실행 카세트에 배치합니다. 실행 중인 카세트를 탱크 내부에 놓습니다.
새로 준비된 1X TBE, pH 8.2를 붓습니다. 빗을 조심스럽게 제거합니다. 버퍼를 피펫하여 젤의 우물을 철저히 씻으십시오.
이 단계는 우물에서 우레아의 침전을 제거하고 RNA가 젤을 가로 질러 균일하게 실행되도록 완화합니다. 장치의 뚜껑을 닫고 빈 젤을 80 볼트에서 30 분 동안 미리 실행하여 버퍼 누설을 확인합니다. 10mL 로딩 염료를 준비하기 위해 브로모페놀 블루 5 mg, 자일렌 시안놀 5 mg의 무게를 달고 10mL의 디오이니화 포름아미드를 넣고 잘 섞는다.
염료를 알리쿼트하고 추가 사용을 위해 4도에 보관하십시오. Aliquot 10 멸균 1.5 mL 튜브에 총 RNA의 마이크로 그램. RNA의 품질, 즉 확인하십시오.
260:230 비율은 2보다 크거나 두 개에 가깝습니다. 튜브를 speedVac 내부에 놓고 샘플을 진공 건조시킵니다. 건조 된 RNA 샘플을 8 마이크로 리터의 적재 염료로 다시 중단합니다.
샘플을 98도에서 2분간 가열합니다. 실온에서 1분 동안 식힙니다. 냉각된 RNA 샘플을 소용돌이로 하여 적재염에 적절한 재서스펜션을 보장합니다.
튜브를 회전합니다. 무료 흐르는 RNA를 얻기 위한 3회 동안 가열, 냉각 및 소용돌이의 단계를 반복하십시오. 젤의 사전 실행을 중지합니다.
우물 내부의 우레아의 퇴적물을 제거하기 위해 샘플을적재하기 전에 우물을 철저히 씻으십시오. 다시 중단된 RNA 샘플을 98도에서 1분간 가열합니다. 모세관 팁을 사용하여 샘플을 우물에 뜨겁게 적재합니다.
기포를 도입하지 마십시오. 모든 샘플을 완벽하게 적재하고 뚜껑을 조립합니다. 젤을 80볼트에서 3시간 동안 또는 브로모페놀 블루가 완전히 실행될 때까지 실행합니다.
이송에 양전하 나일론 멤브레인을 사용하십시오. 유리 판의 치수로 잘라. 오른쪽 상단 모서리에 멤브레인에 라벨을 부착합니다.
살균 밀리큐 물 표면에 멤브레인을 부드럽게 배치하여 라벨 측면을 물 표면을 향하여 아래쪽으로 놓습니다. 깨끗한 트레이를 가지고 전기 전송젤 샌드위치를 준비합니다. 카세트의 회색 면을 아래로 놓습니다.
카세트 의 수준 보다 약간 높은 1X TBE를 붓습니다. 섬유 패드를 1X TBE로 미리 적시고 짜서 기포를 제거합니다. 버팅 페이퍼 2장을 섬유 패드 크기로 자른다.
1X TBE에 블로팅 페이퍼 를 미리 적시고 섬유 패드 위에 놓습니다. 플라스틱 파이펫을 종이 위에 굴려 기포를 제거합니다. 1X TBE에 또 다른 블로팅 페이퍼를 미리 적시고 카세트 위에 놓습니다.
기포를 제거하기 위해 롤오버합니다. 이제 샌드위치 설정이 전기 전송을 위한 준비가 되었습니다. 전기 전도가 완료 된 후, 실행을 중지하고 장치에서 뚜껑을 제거합니다.
설정에서 실행 중인 카세트를 제거합니다. 달리는 카세트에서 유리 판을 꺼내십시오. 조심스럽게 조립에서 젤을 제거합니다.
첫 번째 로드 된 RNA 샘플이 오른쪽쪽으로 있도록 얼룩종이 위에 놓습니다. 미리 담근 멤브레인을 1X TBE에 부드럽게 담그고 젤 위에 놓고 라벨이 부착된 면을 아래로 향합니다. 멤브레인과 젤이 건조되는 것을 허용하지 마십시오.
부드럽게 롤오버하여 기포를 제거합니다. 1X TBE에 얼룩진 종이 한 조각을 찍어 멤브레인 위에 놓습니다. 기포를 제거합니다.
다른 조각을 얼룩지는 종이를 놓고 기포를 제거합니다. 조립에 섬유 패드를 놓고 샌드위치를 완료합니다. 카세트를 단단히 닫습니다.
모듈에 트랜스 블롯 카세트를 배치합니다. 탱크를 1X TBE, pH 8.2로 채우고 블로팅 마크까지. 장치의 뚜껑을 닫고 4도 또는 차가운 방에서 하룻밤 사이에 10 볼트로 옮춥습니다.
UV 크로스 링커를 준비 상태로 유지하고 전기 전달이 완료되기 직전에 1200으로 설정합니다. 전송이 완료된 후 모듈에서 카세트를 제거합니다. 젖은 멤브레인을 A4 시트에 놓고 표시된 면을 위쪽으로 놓습니다.
120 밀리 주에서 254 나노 미터 UV 빛으로 조사하여 RNA를 멤브레인에 교차 연결합니다. 교차 연결된 블롯은 4도에서 저장되거나 혼성화에 사용될 수 있다. 검출해야 하는 작은 RNA에 완전히 무료프로브를 설계한다.
PNK 효소를 사용하여 5개의 프라임 엔드에서 프로브를 최종 라벨로 표시하고 표시된 대로 구성 요소를 결합합니다. 반응 혼합물을 37도에서 30분 동안 배양합니다. 30분 동안 배양한 후 G-25 컬럼을 사용하여 표지되지 않은 프로브를 반응 혼합물과 분리합니다.
프로브의 라벨을 개선하면 사용하기 전에 G-25 열을 준비하십시오. 블롯, RNA 측을 위쪽으로 향하여 혼성화 병 안에 놓습니다. 사용하기 전에 하이브리드화 버퍼를 적극적으로 혼합합니다.
10mL의 혼성화 버퍼를 내부에 추가하고 혼성화 오븐 내부에 혼성화 병을 배치하고 회전시 35도에서 유지합니다. 20~30분 동안 사전 혼성화를 수행합니다. 사전 혼성화 후 오븐에서 병을 제거합니다.
레이블이 표시된 프로브를 하이브리드화 버퍼에 부드럽게 추가합니다. 기포가 생성되지 않았는지 확인합니다. 오븐 내부의 블롯을 35도에서 12시간 동안 회전하여 배양합니다.
혼성화 후 병에서 혼성화 버퍼를 제거합니다. 워시 버퍼-I를 사용하여 블롯을 빠르게 세척하십시오. 이 단계는 슬롯에서 과도한 혼성화 용액을 제거하기 위해 수행됩니다.
세척 버퍼-I를 사용하여 30분 동안 35도에서 블롯을 추가로 배양합니다. 30분 동안 35도에서 완충II를 사용하여 또 다른 세척을 수행합니다. 블롯을 세척한 후 혼성화 커버 안에 놓고 여분의 버퍼를 제거하고 밀봉합니다.
카세트 안에 놓고 12 시간 동안 방사선 없는 인인- 이미저 화면에 노출시세요. 태풍 생체 분자 이미저를 사용하여 혼성화 신호를 감지하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다. 다른 프로브와 블롯의 혼성화를 위해 그림과 같이 제거 단계를 수행합니다.
이 기술로 마이크로 RNA의 풍부뿐만 아니라 길이를 추정 할 수 있습니다. 이 이미지로부터, 마이크로 RNA(397)의 발현은 모든 샘플에서 검출될 수 있다. 이 블롯에서, 샘플 하나의 풍부는 백만 당 약 5 읽기, 차세대 시퀀싱 데이터에 따라, 우리의 기술도 덜 풍부한 마이크로 RNA를 감지 할 수 있음을 시사.
또한 ImageJ 정량화 소프트웨어를 사용하여 샘플 중 마이크로 397의 발현을 정량화할 수 있다. 여기에서 우리는 적재 제어로 U6 및 마이크로 RNA 168을 사용했습니다. 나는 실험을 수행하는 동안 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계에 대해 이야기 할 것입니다.
샘플 준비를 위해 양질의 RNA를 사용해야 합니다. 진공 건조 시 료를 건조 하는 동안, 그들을 건조 이상 하지 마십시오. 로딩 염료에서 RNA의 재현탁은 매우 중요합니다.
흐르는 무료 샘플을 준비하십시오. 젤을 적재하는 동안주의를 기울여야 합니다. 젤의 우물은 세척해야하며 샘플은 우물 내부의 직선으로로드해야합니다.
전기 전이 중, 물에 멤브레인의 확산, 1X TBE에 담그기 직전에 필수적이다, 그것은 전송을 향상시킨다. 블롯의 혼성화는 35도에서 수행해야 합니다. 혼성화 오븐의 온도를 유지합니다.
얼룩을 반복적으로 사용하려면 멤브레인을 4도에 저장해야합니다. 그들은 2 배 SSE에 습기를 유지해야합니다. 다른 PCR 기반 방법과 달리,이 방법은 마이크로 RNA의 크기의 결정뿐만 아니라 식의 정량화를 보장합니다.
