Oi. Então este é um pequeno protocolo RNA norte. É uma derivada de protocolo originalmente otimizada pelo Dr. Rashid Akbergenov.
Neste método, pode-se detectar pequenos RNA's de qualquer lugar entre 20-24 nucleotídeos de comprimento, muito precisamente e em alta resolução. O protocolo é basicamente uma forma modificada de análise tradicional do Norte, mas aqui, a porcentagem de acrilamida é bastante alta, é de 15%. Este norte pode ser usado para detectar RNA pequeno já conhecido, seja micro RNA ou outro conjunto de RNA pequeno, quando a sequência é conhecida ou pode ser usada para confirmação de abundância de RNA pequeno vindo de conjuntos de dados de sequenciamento de próxima geração.
A vantagem deste método é que, não se pode apenas olhar para a abundância de micro RNA, mas também a abundância de precursores, por exemplo micro RNAs pode deixar de fora um precursor que é em torno de 30 a ser algumas centenas de nucleotídeos de comprimento, isso também pode ser detectado simultaneamente, juntamente com o micro RNA. O protocolo é muito simples, muito direto, mas é preciso ser muito cauteloso ao executar alguns passos críticos que estão listados no final deste protocolo. Para a preparação de 10 mL de mistura de gel, adicione 4,8 gramas de ureia, 3,75 mL de solução de acrilamida de 40% e 1 mL de 10X TBE recém-preparado, pH 8.2 e misture suavemente a solução.
Dissolva completamente a ureia, aquecendo a mistura em um banho de água, até que a solução pareça clara. Coma o volume até 10 mL, usando água MilliQ estéril e esfrie a mistura de gel à temperatura ambiente. Lave o aparelho necessário com detergente, esfregue-os suavemente para remover TBE e Acrilamida residuais.
Enxágüe-os ainda mais com água MilliQ e deixe-a secar. Monte a placa de vidro juntos, certifique-se de que ambos estão no mesmo nível. Coloque-os firmemente sobre a esponja.
Adicione 8 micro litros de TEMED e 80 micro litros de APS 10% recém-preparados ao mix de gel. Misture delicadamente e despeje a mistura de gel nas placas montadas. Certifique-se de que o gel não vaze.
Coloque o pente com cuidado. Deixe o gel polimerizar por aproximadamente 45 minutos. Após a polimerização do gel, remova as placas de vidro do conjunto.
Lave as placas de vidro com água MilliQ. E coloque-os na fita de corrida. Coloque o funcionando dentro do tanque.
Despeje recém-preparado 1X TBE, pH 8.2. Remova o pente cuidadosamente. Lave bem os poços do gel, encanar o tampão.
Esta etapa remove precipitações de ureia do poço e facilita o RNA para correr uniformemente através do gel. Feche a tampa do aparelho e pré-execute o gel vazio a 80 volts por 30 minutos, para verificar se há algum vazamento de buffer. Para a preparação de 10 mL de corante de carga, pese 5 mg de azul bromofenol, 5 mg de cianol de xileno e adicione 10 mL de formamida deioinizada e misture-os bem.
Aliquot o corante e armazene a 4 graus para uso posterior. Alíquota 10 microgramas de RNA total em tubos estéreis de 1,5 mL. Certifique-se de que a qualidade do RNA, ou seja.
a proporção 260:230 é maior ou mais próxima de duas. Coloque o tubo dentro de uma velocidadeVac e seque as amostras. Suspenda as amostras de RNA secas em 8 micro litros de corante de carregamento.
Aqueça as amostras a 98 graus por dois minutos. Esfrie-os por um minuto em temperatura ambiente. Vórtice as amostras de RNA resfriadas para garantir a suspensão adequada no corante de carregamento.
Gire os tubos. Repita os passos de aquecimento, resfriamento e vórtice por três vezes para obter RNA fluindo livremente. Pare a pré-execução do gel.
Lave bem os poços, antes de carregar a amostra, para remover os depósitos da ureia dentro dos poços. Aqueça as amostras de RNA re-suspensas a 98 graus por um minuto. Coloque as amostras quentes nos poços usando pontas capilares.
Evite introduzir bolhas de ar. Carregamento completo de todas as amostras e montar a tampa. Execute o gel a 80 volts por três horas ou até que o azul bromofenol corra completamente.
Use membrana de nylon carregada positivamente para a transferência. Corte-o nas dimensões da placa de vidro. Rotule a membrana no canto superior direito.
Coloque suavemente a membrana na superfície da água MilliQ estéril certifique-se de colocar o lado da etiqueta para baixo, de frente para a superfície da água. Pegue uma bandeja limpa e prepare o sanduíche de gel para a transferência de eletro. Coloque o lado cinza da fita para baixo.
Despeje 1X TBE ligeiramente acima do nível do. Pré-molhe a almofada de fibra em 1X TBE e esprema-a para remover bolhas de ar. Corte dois pedaços de papel manchado do tamanho de fibra.
Pré-molhar um pedaço de papel manchado em 1X TBE e colocá-lo sobre a almofada de fibra. Remova as bolhas de ar rolando uma pipeta de plástico sobre o papel. Pré-molhar outro pedaço de papel manchado em 1X TBE e colocá-lo sobre o.
Role para remover bolhas de ar. Agora a configuração do sanduíche está pronta para transferência de eletro. Após a conclusão da eletroforese, pare a corrida e remova a tampa do aparelho.
Remova o de execução da configuração. Tire as placas de vidro do. Remova cuidadosamente o gel da montagem.
Coloque-o sobre o papel de mancha de tal forma que a primeira amostra de RNA carregada seja para a sua direita. Mergulhe suavemente a membrana pré-encharcada em 1X TBE e coloque-a sobre o gel, de frente para o lado rotulado para baixo. Não deixe a membrana e o gel secarem.
Role suavemente para remover a bolha de ar. Mergulhe um pedaço de papel manchado em 1X TBE e coloque-o sobre a membrana. Remova bolhas de ar.
Coloque outro pedaço de papel manchado e remova as bolhas de ar. Complete o sanduíche colocando a almofada de fibra sobre o conjunto. Feche a fita com firmeza.
Coloque o trans-blot no módulo. Encha o tanque com 1X TBE, pH 8.2, até a marca de manchas. Feche a tampa do aparelho e transfira a 10 volts durante a noite a 4 graus ou em uma sala fria.
Mantenha o linker cruzado UV pronto e coloque-o em 1200, pouco antes da conclusão da transferência de eletro. Após a conclusão da transferência, remova o do módulo. Coloque a membrana úmida em uma folha A4, colocando o lado marcado para cima.
Cruze o RNA à membrana por irradiação com 254 nanômetros de luz UV a 120 milissegundos. A mancha transversal pode ser armazenada em quatro graus ou usada para hibridização. Projete uma sonda que seja completamente complementar ao pequeno RNA que precisa ser detectado.
Rotule a sonda em cinco extremidades prime usando enzima PNK e combine os componentes como mostrado. Incubar a mistura de reação a 37 graus por 30 minutos. Após 30 minutos de incubação use colunas G-25 para separar sondas não rotuladas da mistura de reação.
Para uma rotulagem melhorada da sonda, prepare a coluna G-25 antes de usar. Coloque a mancha, lado RNA de frente para cima, dentro de uma garrafa de hibridização. Misture vigorosamente o tampão de hibridização antes de usar.
Adicione 10 mL de tampão de hibridização dentro e coloque a garrafa de hibridização dentro do forno de hibridização, mantenha a 35 graus com rotação. Realizar a pré-hibridização por 20 a 30 minutos. Após a pré-hibridização, retire a garrafa do forno.
Adicione a sonda rotulada no buffer de hibridização suavemente. Certifique-se de que as bolhas de ar não sejam criadas. Incubar a mancha dentro do forno a 35 graus com rotação por 12 horas.
Após a hibridização, remova o tampão de hibridização da garrafa. Realize uma lavagem rápida das manchas, usando tampão de lavagem-I. Esta etapa é realizada para remover o excesso de solução de hibridização das manchas.
Incubar ainda mais as manchas a 35 graus por 30 minutos usando tampão de lavagem-I. Realize outra lavagem usando buffer-II a 35 graus por 30 minutos. Após a lavagem da mancha, coloque-a dentro de uma tampa de hibridização, remova o excesso de tampão e sele-a.
Coloque-o dentro de um e exponha-o a uma tela de imagem fosfo livre de radiação por 12 horas. Detecte o sinal de hibridização usando o imager biomolecular tufão e analise os resultados usando o software ImageJ. Para hibridização da mancha com outras sondas, execute etapas de descascamento como ilustrado.
Com esta técnica pode-se estimar a abundância de micro RNA, bem como seu comprimento. A partir desta imagem, a expressão do micro RNA 397 pode ser detectada em todas as amostras. Nesta mancha, a abundância de amostra é de aproximadamente 5 leituras por milhão, conforme dados de sequenciamento de próxima geração, sugerindo que nossa técnica pode detectar micro RNAs menos abundantes também.
Além disso, utilizando o software de quantificação ImageJ, pode-se quantificar a expressão do micro 397 entre as amostras. Aqui usamos U6 e micro RNA 168 como controles de carregamento. Falarei de alguns passos cruciais que devem ser considerados durante a realização do experimento.
Certifique-se de usar RNA de boa qualidade para preparação da amostra. Enquanto o vácuo seca as amostras, evite secá-las demais. A re-suspensão do RNA no corante de carregamento é fundamental.
Certifique-se de preparar uma amostra de fluxo livre. Deve-se tomar cuidado durante o carregamento do gel. Os poços do gel devem ser lavados e a amostra deve ser carregada em linha reta dentro dos poços.
Durante a transferência de eletro, a disseminação da membrana na água, pouco antes de mergulhá-la em 1X TBE é essencial, melhora a transferência. A hibridização da mancha deve ser realizada a 35 graus. Mantenha a temperatura do forno de hibridização.
Para o uso repetido das manchas, as membranas devem ser armazenadas em 4 graus. Eles devem ser mantidos úmidos em 2X SSE. Ao contrário de outros métodos baseados em PCR, este método garante a quantificação da expressão, bem como a determinação do tamanho das micro RNAs.
