Este método mantém amostras biológicas em um ambiente nativo e reduz o artefato induzido pelo feixe de elétrons. A principal vantagem é que essa técnica é aplicável a células inteiras. Assim, as células não precisam ser desidratadas, manchadas ou seccionadas antes da microscopia eletrônica.
A capacidade de imagem de receptores em células cancerosas no contexto de toda a membrana plasmática intacta é um aspecto importante que pode levar a novas abordagens terapêuticas e ao desenvolvimento de novas drogas anticancerígenas. Vou demonstrar o trabalho com células, revestimento de grafeno e microscopia, e Sercan Keskin mostrará como preparar o grafeno. Para começar, adicione 100 microliters de suspensão celular a dois poços de uma placa de 96 poços contendo microchips revestidos PLL e FLP com a membrana de nitreto de silício voltada para cima e 50 microliters de meio livre de soro.
Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco minutos para permitir que as células se conectem ao microchip. Verifique a densidade das células do microchip com um microscópio invertido e certifique-se de que as células cobrem a janela com espaço suficiente para achatar e aderir. Para rotular HER2 nas células, coloque os microchips nos poços da primeira linha da placa de rotulagem.
Em seguida, lave os microchips com PBS BSA. Para evitar a ligação inespecífica do mimético do anticorpo, incubar os microchips com PBS BSA GS por cinco minutos. Em seguida, com 200 anticorpos nanomolar miméticos por 10 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Para remover o grafeno PMMA do polímero, pipeta algumas gotas de água no polímero ao redor do grafeno PMMA. Em seguida, mergulhe-o na água com um ângulo de 30 a 45 graus para liberar o grafeno PMMA. Para gravar contaminantes à base de cobre, prepair uma solução de 50 mililitros de 0,42 persulfeto de sódio molar na água.
Use uma lâmina de vidro padrão para transferir o grafeno PMMA para a solução de persulfito de sódio com o lado do grafeno para baixo. O grafeno PMMA flutuará até o topo da solução. Deixe lá durante a noite.
No dia seguinte, transfira o grafeno PMMA da solução de persulfeto de sódio para água limpa. Deixe flutuar na água por meia hora. Repita a lavagem um total de três vezes para remover todos os resíduos de persulfito de sódio do grafeno PMMA.
Em seguida, transfira o grafeno PMMA para um cristal de cloreto de sódio. Prepare uma solução saturada de cloreto de sódio na água em uma placa de Petri e transfira o grafeno PMMA em cima da solução com o lado do grafeno para baixo. Segure o cristal do cloreto de sódio com pinças e pegue o grafeno PMMA flutuante.
Em seguida, segure-o verticalmente por dois minutos para deixar o excesso de água fluir. Deixe secar até a temperatura ambiente por 30 minutos e asse em um forno a 100 graus Celsius por 20 minutos. Remova completamente a água.
Pré-aqueça acetona em uma placa de vidro Petri a aproximadamente 50 graus Celsius em uma placa quente no capô da fumaça. Observe a temperatura cuidadosamente para evitar o fogo. Mergulhe o grafeno PMMA no sal na placa de Petri cheia de acetona e deixe dissolver o PMMA por 30 minutos.
Deixe o grafeno sobre o ar salgado secar completamente antes de usá-lo para preparação da amostra. Lave um microchip preparado e rotulado em água pura para remover quaisquer resíduos de sal do tampão e coloque-o no papel filtro. As células devem ser visíveis como manchas escuras.
Use uma lâmina de barbear para cortar o grafeno multicamadas no cristal do cloreto de sódio em uma peça que se encaixa na janela de nitreto de silício de um microchip. Remova o grafeno do cristal do cloreto de sódio mergulhando-o em um béquer de água, inclinando o cristal em um ângulo de 45 graus em relação à superfície. Pegue o grafeno com uma alça metálica da superfície da água, depois toque na superfície superior do microchip com a superfície inferior do laço, fazendo com que o microchip grude na alça metálica.
O grafeno pode ser visto em cima do microchip. Sob um estereótipo, use papel filtro para remover a água restante do microchip para que o grafeno cubra todas as células da janela do nitreto de silício. Coloque o microchip em um papel filtro com pinças.
O grafeno é visível como um brilho roxo no microchip. Transfira o microchip do papel para uma placa de Petri compartimental. Pipeta uma gota de água em um dos compartimentos livres e feche a tampa para fornecer uma atmosfera saturada de água.
Em seguida, sele o prato do compartimento com filme de parafina e guarde-o na geladeira a quatro graus Celsius. Ajuste o STEM para 200 quilovolt de energia do feixe usando uma amostra de alinhamento para um tamanho de sonda de pelo menos 0,2 nanômetros, ajustando as lentes do condensador. Defina uma corrente de sonda de 180 Picoampere e um feixe de convergência semiângulo de 13,2 milagrianos inserindo uma abertura.
Ajuste o detector ADF STEM abrindo faixa de semiângulo para 68 a 280 milradianos ajustando as configurações da lente do projetor. Em seguida, defina o tamanho da imagem STEM para 2048 por 2048 pixels e o tempo de consumo de pixels para seis microsegundos. Carregue o microchip com células revestidas de grafeno em um suporte padrão de espécime para ter de tal forma que as células estejam viradas para cima e carregue o suporte no microscópio eletrônico.
Adquira uma imagem geral na ampliação de 800 X. Em seguida, identifique uma região de interesse e imagem das nanopartículas de ponto quântico a 80.000 X com um tamanho de pixel de 1,3 nanômetros. Células semeadas são mostradas aqui.
A janela está coberta, mas há espaço suficiente para permitir que eles se achatem e aderam. Quando muitas células foram semeadas em um microchip, não havia espaço suficiente para todas as células aderirem. Depois de 24 horas, mais da metade das células não se achatava.
Se poucas células forem semeadas, a janela do nitreto de silício acabará com um grande espaço vazio após 24 horas. Imagens de DIC e fluorescência de células semeadas são mostradas aqui, demonstrando rotulagem bem sucedida de HER2. O STEM foi realizado em células SKBR3 revestidas de grafeno e não revestidas.
Os insets nas imagens de ampliação de 800 X foram imagens a 80.000 X.As nanopartículas de ponto quântico são visíveis como pontos brilhantes na ampliação de 50.000 X. Para investigar o efeito da iluminação do feixe de elétrons na amostra, as imagens STEM foram adquiridas em uma série de imagens com uma dose eletrônica acumulada. Os resultados representativos para amostras não revestidas e revestidas de grafeno são mostrados aqui.
A exposição de amostras não revestidas levou a estruturas brilhantes que apareciam nas superfícies celulares, o que não ocorreu com nenhuma das amostras revestidas de grafeno. A variação média da distância relativa dos pares de partículas permaneceu abaixo de 1,3% para amostras não revestidas e abaixo de 0,8% para as amostras revestidas. Após este procedimento, diferentes tipos de proteínas de membrana podem ser imagens em células inteiras usando outros métodos de microscopia.
Esta técnica permite a imagem de proteínas na membrana plasmática intacta para obter mais informações sobre a organização da membrana plasmática e a interação entre proteínas.
