هذه الطريقة تحافظ على العينات البيولوجية في بيئة محلية ويقلل من شعاع الإلكترون الناجم عن القطع الأثرية. الميزة الرئيسية هي أن هذه التقنية قابلة للتطبيق على خلايا كاملة. لذلك لا تحتاج الخلايا إلى الجفاف أو الملطخة أو المقطعة قبل المجهر الإلكتروني.
القدرة على صورة المستقبلات على الخلايا السرطانية في سياق غشاء البلازما كله سليمة هو جانب رئيسي يمكن أن يؤدي إلى نهج العلاج الجديد وتطوير أدوية جديدة لمكافحة السرطان. سوف أثبت العمل مع الخلايا، طلاء الجرافين، والمجهر، وسيركان كيسكين سوف تظهر كيفية إعداد الجرافين. للبدء، إضافة 100 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى بئرين من 96 بئر لوحة تحتوي على PLL و FLP المغلفة رقائق صغيرة مع غشاء نيتريد السيليكون التي تواجه لأعلى و 50 ميكرولترات من المتوسطة خالية من المصل.
احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس دقائق للسماح للخلايا لتعلق على رقاقة. تحقق من كثافة الخلايا الموجودة على الرقاقة مع مجهر مقلوب وتأكد من أن الخلايا تغطي النافذة بمساحة كافية لتسطيحها والتمسك بها. لوضع علامة HER2 في الخلايا، ضع الرقائق الدقيقة في آبار الصف الأول من لوحة الملصقات.
ثم، وغسل الرقائق مع برنامج تلفزيوني BSA. لمنع الربط غير المحدد للجسم المضاد، قم باحتضان الرقائق الدقيقة باستخدام PBS BSA GS لمدة خمس دقائق. ثم مع 200 نانومولر الأجسام المضادة المحاكاة لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
لإزالة الجرافين PMMA من البوليمر، ماصة بضع قطرات من الماء على البوليمر حول الجرافين PMMA. ثم، تزج به في الماء بزاوية من 30 إلى 45 درجة لإطلاق الجرافين PMMA. لحفر الملوثات القائمة على النحاس، prepair حل 50 ملليلتر من 0.42 بيرسول الصوديوم في الماء.
استخدام شريحة زجاجية قياسية لنقل الجرافين PMMA في محلول persulfate الصوديوم مع الجانب الجرافين إلى أسفل. سوف تطفو الجرافين PMMA إلى أعلى الحل. اتركه هناك بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، نقل الجرافين PMMA من محلول persulfate الصوديوم إلى المياه النظيفة. دعه يطفو في الماء لمدة نصف ساعة. كرر الغسيل ما مجموعه ثلاث مرات لإزالة جميع بقايا persulfate الصوديوم من الجرافين PMMA.
ثم، نقل الجرافين PMMA على الكريستال كلوريد الصوديوم. إعداد محلول مشبع من كلوريد الصوديوم في الماء في طبق بيتري ونقل الجرافين PMMA على رأس الحل مع الجانب الجرافين أسفل. عقد الكريستال كلوريد الصوديوم مع ملاقط والتقاط الجرافين PMMA العائمة.
ثم، عقد عموديا لمدة دقيقتين للسماح للمياه الزائدة تتدفق. اتركه يجف إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ويخبز في فرن عند 100 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إزالة المياه تماما.
سخني الأسيتون في طبق بيتري زجاجي إلى ما يقرب من 50 درجة مئوية على لوحة ساخنة في غطاء الدخان. مشاهدة درجة الحرارة بعناية لتجنب الحريق. غمر الجرافين PMMA على الملح في طبق بيتري مليئة الأسيتون وتركها لحل PMMA لمدة 30 دقيقة.
السماح للجرافين على الملح الهواء الجاف جيدا قبل استخدامه لإعداد العينة. غسل واحدة أعدت وتسمى رقاقة في الماء النقي لإزالة أي مخلفات الملح من العازلة ووضعها على ورقة التصفية. يجب أن تكون الخلايا مرئية كنقاط داكنة.
استخدام شفرة حلاقة لقطع الجرافين متعدد الطبقات على الكريستال كلوريد الصوديوم إلى قطعة التي تناسب نافذة نيتريد السيليكون من رقاقة. إزالة الجرافين من الكريستال كلوريد الصوديوم عن طريق غمس في منقار من الماء، إمالة الكريستال في زاوية 45 درجة فيما يتعلق السطح. قبض على الجرافين مع حلقة معدنية من سطح الماء، ثم لمس السطح العلوي من رقاقة مع سطح الحلقة السفلى، مما تسبب في رقاقة التمسك حلقة معدنية.
ويمكن رؤية الجرافين على رأس رقاقة. تحت مجسمة، استخدم ورقة التصفية لإزالة الماء المتبقي من الرقائق الدقيقة بحيث يغطي الجرافين جميع الخلايا على نافذة نيتريد السيليكون. ضع الرقاقة على ورق المرشح مع ملاقط.
الجرافين مرئيا ً كوميض أرجواني على الرقاقة. نقل رقاقة من ورقة إلى حجرة طبق بيتري. ماصة قطرة من الماء في واحدة من المقصورات الحرة وإغلاق الغطاء لتوفير جو المياه المشبعة.
ثم، ختم طبق المقصورة مع فيلم البارافين وتخزينها في الثلاجة في أربع درجات مئوية. تعيين STEM إلى 200 كيلوفولت طاقة شعاع باستخدام عينة محاذاة لحجم المسبار لا يقل عن 0.2 نانومتر عن طريق ضبط العدسات المكثف. تعيين تيار التحقيق من 180 Picoampere وشعاع التقارب شبه زاوية من 13.2 milliradians عن طريق إدراج فتحة.
تعيين كاشف ADF STEM فتح نطاق شبه زاوية إلى 68 إلى 280 milliradians عن طريق ضبط إعدادات عدسة البروجيكتور. ثم، تعيين حجم الصورة STEM إلى 2048 من قبل 2048 بكسل والبكسل يسكن الوقت إلى ستة ميكروثانية. تحميل رقاقة مع الخلايا المغلفة الجرافين في حامل عينة القياسية للتيم في مثل هذه الطريقة التي تواجه الخلايا حتى وتحميل حامل في المجهر الإلكتروني.
الحصول على صورة عامة في 800 X التكبير. ثم، تحديد منطقة ذات أهمية وصورة للجسيمات النانوية نقطة الكم في 80، 000 X مع حجم بكسل من 1.3 نانومتر. تظهر الخلايا المصنفة على النحو الأمثل هنا.
يتم تغطية النافذة ، ولكن هناك مساحة كافية للسماح لهم بالارض والتمسك بها. عندما تم زرع الكثير من الخلايا على رقاقة ، لم يكن هناك مساحة كافية لجميع الخلايا للتمسك. بعد 24 ساعة، أكثر من نصف الخلايا لم تتسطح.
إذا تم زرع عدد قليل جدا من الخلايا، فإن نافذة نيتريد السيليكون في نهاية المطاف مع مساحة فارغة كبيرة بعد 24 ساعة. تظهر هنا صور DIC و fluorescence للخلايا المصنفة على النحو الأمثل ، مما يدل على وضع العلامات الناجحة لـ HER2. تم تنفيذ STEM على خلايا SKBR3 المغلفة بالجرافين وغير المغلفة.
تم تصوير insets في الصور التكبير 800 X في 80، 000 X.The الجسيمات النانوية نقطة الكم مرئية كما النقاط المضيئة في 50، 000 X التكبير. ومن أجل تحري تأثير إضاءة شعاع الإلكترون على العينة، تم الحصول على صور STEM في سلسلة صور بجرعة إلكترون متراكمة. تظهر هنا نتائج تمثيلية للعينات غير المغلفة والمغلفة بالجرافين.
أدى التعرض للعينات غير المغلفة إلى ظهور هياكل ساطعة على أسطح الخلايا ، وهو ما لم يحدث مع أي من العينات المغلفة بالجرافين. بقي متوسط تغيير المسافة النسبية لأزواج الجسيمات أقل من 1.3٪ للعينات غير المغلفة وأقل من 0.8٪ للعينات المغلفة. بعد هذا الإجراء، يمكن تصوير أنواع مختلفة من البروتينات الغشاء على خلايا كاملة باستخدام أساليب المجهر الأخرى.
هذه التقنية تجعل من الممكن لصورة البروتينات في غشاء البلازما سليمة للحصول على مزيد من المعلومات حول تنظيم غشاء البلازما والتفاعل بين البروتينات.
