שיטה זו שומרת דגימות ביולוגיות בסביבה מקומית ומפחיתה את החפץ המושרה על ידי קרן אלקטרונים. היתרון העיקרי הוא כי טכניקה זו ישימה לתאים שלמים. אז תאים לא צריכים להיות מיובשים, מוכתמים, או חתוכו לפני מיקרוסקופ אלקטרונים.
היכולת דימוי קולטנים על תאים סרטניים בהקשר של קרום פלזמה שלם כולו הוא היבט מרכזי שיכול להוביל גישות טיפול חדשות ופיתוח של תרופות נגד סרטן חדש. אני אדגים את העבודה עם תאים, ציפוי גרפן ומיקרוסקופיה, וסרקן קסקין יראה איך להכין את גרפן. כדי להתחיל, להוסיף 100 microliters של השעיית התא לשתי בארות של צלחת 96 גם המכיל שבבים מצופים PLL ו FLP עם קרום סיליקון ניטרייד מול למעלה ו 50 microliters של מדיום ללא סרום.
דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך חמש דקות כדי לאפשר לתאים לצרף שבב. בדוק את צפיפות התאים על השבב עם מיקרוסקופ הפוך וודא כי התאים מכסים את החלון עם מספיק מקום כדי לשטח ולדבוק. כדי לתייג את HER2 בתאים, מקם את השבבים לתוך בארות השורה הראשונה של לוחית התיוג.
לאחר מכן, לשטוף את השבבים עם PBS BSA. כדי למנוע כריכה לא ספציפית של מימטי הנוגדן, הדגירה שבבים עם PBS BSA GS במשך חמש דקות. ואז עם 200 מימטי נוגדן ננומולרי במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
כדי להסיר את גרפן PMMA מן הפולימר, פיפטה כמה טיפות מים על הפולימר סביב גרפן PMMA. לאחר מכן, לטבול אותו במים עם זווית של 30 עד 45 מעלות כדי לשחרר את גרפן PMMA. כדי לחרוט מזהמים מבוססי נחושת, prepair פתרון 50 מיליליטר של 0.42 נתרן טוחן לשכנע במים.
השתמש בשקופית זכוכית סטנדרטית כדי להעביר גרפן PMMA לתוך פתרון שכנוע נתרן עם צד גרפן למטה. גרפן PMMA יצוף לראש הפתרון. תשאיר את זה שם למשך הלילה.
למחרת, להעביר את גרפן PMMA מתסמת שכנוע נתרן למים נקיים. תן לו לצוף במים במשך חצי שעה. חזור על לשטוף בסך הכל שלוש פעמים כדי להסיר את כל שאריות נתרן שכנוע מן גרפן PMMA.
לאחר מכן, להעביר את גרפן PMMA על גבייש נתרן כלורי. מכינים פתרון רווי של נתרן כלורי במים בצלחת פטרי ומעבירים את גרפן PMMA על גבי הפתרון עם צד גרפן למטה. החזיקו את גביש הנתרן כלורי עם פינצטה וקפו את גרפן PMMA הצף.
לאחר מכן, החזק אותו אנכית במשך שתי דקות כדי לאפשר למים עודפים לזרום החוצה. תן לו להתייבש לטמפרטורת החדר במשך 30 דקות ואופים אותו בתנור ב 100 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הסר לחלוטין את המים.
מחממים אצטון בצלחת פטרי מזכוכית לכ-50 מעלות צלזיוס על צלחת חמה במכסה המנוע. צפה בטמפרטורה בזהירות כדי למנוע אש. טובל את גרפן PMMA על מלח לתוך צלחת פטרי מלא אצטון ולהשאיר אותו כדי להמיס את PMMA במשך 30 דקות.
תן גרפן על מלח אוויר יבש ביסודיות לפני השימוש בו להכנת מדגם. לשטוף שבב מוכן ומסויג במים טהורים כדי להסיר את כל שאריות המלח מהחוצץ ולה מניח אותו על נייר מסנן. התאים צריכים להיות גלויים כנקודות כהות.
השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את גרפן רב שכבתי על גביש נתרן כלורי לתוך חתיכה שמתאימה חלון ניטרד סיליקון של שבב זעיר. הסר את גרפן מקריסטל נתרן כלורי על ידי טבילתו בתוך מקור מים, הטיית הגביש בזווית של 45 מעלות ביחס לפני השטח. לתפוס את גרפן עם לולאת מתכת מפני השטח של המים, ואז לגעת את פני השטח העליונים של השבב עם משטח הלולאה התחתונה, גורם שבב להידבק לולאת המתכת.
גרפן ניתן לראות על גבי השבב. תחת סטריאומיקרוסקופ, השתמש בנייר סינון כדי להסיר את המים הנותרים מהשבב כך שהגרפן יכסה את כל התאים בחלון ניטרד הסיליקון. מניחים את השבב על נייר סינון עם פינצטה.
גרפן נראה כמו נצנוץ סגול על השבב. מעבירים את השבב מהנייר לצלחת פטרי תא. פיפטה טיפת מים לתוך אחד התאים החופשיים ולסגור את המכסה כדי לספק אווירה רוויה במים.
לאחר מכן, לאטום את צלחת התא עם סרט פרפין ולאחסן אותו במקרר בארבע מעלות צלזיוס. הגדר את ה-STEM לאנרגיית קרן של 200 קילו-וולט באמצעות דגימת יישור לגודל בדיקה של לפחות 0.2 ננומטר על-ידי התאמת עדשות הדחוס. הגדר זרם בדיקה של 180 Picoampere ו התכנסות קרן חצי זווית של 13.2 מילירדיאנים על ידי החדרת צמצם.
הגדר את גלאי ADF STEM פתיחת טווח חצי זווית ל 68 עד 280 מילירדיאנים על ידי התאמת הגדרות עדשת המקרן. לאחר מכן, הגדר את גודל תמונת STEM ל- 2048 על-ידי 2048 פיקסלים ואת זמן השתהות הפיקסלים לשישה מיקרו-שניות. לטעון את השבב עם תאים מצופים גרפן במחזיק דגימה סטנדרטי עבור tem באופן כזה התאים פונים כלפי מעלה לטעון את המחזיק לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים.
רכישת תמונת מבט כולל בהגדלה של 800 X. לאחר מכן, לזהות אזור של עניין ותמונה של חלקיקי נקודה קוונטית ב 80, 000 X עם גודל פיקסל של 1.3 ננומטר. תאים זרע אופטימלי מוצגים כאן.
החלון מכוסה, אבל יש מספיק מקום כדי לאפשר להם לשטח ולדבוק. כאשר יותר מדי תאים נזרעו על שבב זעיר, לא היה מספיק מקום לכל התאים לדבוק. אחרי 24 שעות, יותר ממחצית התאים לא השתטחו.
אם מעט מדי תאים נזרעים, חלון ניטרד הסיליקון יהיה בסופו של דבר עם שטח ריק גדול לאחר 24 שעות. תמונות DIC ו פלואורסצנטיות של תאים זרע אופטימלי מוצגים כאן, הוכחת תיוג מוצלח של HER2. STEM בוצע על תאי SKBR3 מצופים גרפן ולא מצופים.
ההגדלות של 800 X דימויו ב- 80, 000 X.The חלקיקי נקודה קוונטית גלויים כנקודות בהירות בהגדלה של 50, 000 X. כדי לחקור את ההשפעה של תאורת קרן אלקטרונים על המדגם, תמונות STEM נרכשו בסדרת תמונות עם מינון אלקטרונים מצטבר. תוצאות מייצגות עבור דגימות לא מצופות מצופות גרפן מוצגות כאן.
החשיפה של דגימות שאינן מצופות הובילה למבנים בהירים המופיעים על משטחי התא, אשר לא התרחשו עם אף אחת מהדגימות מצופות גרפן. שינוי המרחק היחסי הממוצע של זוגות חלקיקים נשאר מתחת ל-1.3% עבור דגימות לא מצופות ומתחת ל-0.8% עבור הדגימות המציפות. בעקבות הליך זה, סוגים שונים של חלבוני קרום ניתן לדמיין על תאים שלמים באמצעות שיטות מיקרוסקופיות אחרות.
טכניקה זו מאפשרת תמונה חלבונים קרום פלזמה שלם כדי לקבל מידע נוסף על הארגון של קרום הפלזמה ואת האינטראקציה בין חלבונים.
