Этот метод сохраняет биологические образцы в родной среде и уменьшает индуцированный электронный луч артефакта. Основным преимуществом является то, что этот метод применим к целым клеткам. Таким образом, клетки не должны быть обезвожены, окрашены, или секционированы до электронной микроскопии.
Способность изображения рецепторов на раковых клетках в контексте всей нетронутой плазменной мембраны является одним из основных аспектов, которые могут привести к новым подходам терапии и разработке новых противораковых препаратов. Я продемонстрирую работу с клетками, графен-покрытием и микроскопией, а Серкан Кескин покажет, как подготовить графен. Для начала добавьте 100 микролитров клеточной подвески к двум скважинам из 96 скважин, содержащих микрочипы PLL и FLP с кремниевой нитридной мембраной вверх и 50 микролитров безотхвочной среды.
Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение пяти минут, чтобы клетки прикрепляются к микрочипу. Проверьте плотность клеток на микрочипе с помощью перевернутого микроскопа и убедитесь, что клетки покрывают окно достаточным пространством, чтобы сгладить и придерживаться. Чтобы маркировать HER2 в клетках, поместите микрочипы в колодцы первого ряда маркировки пластины.
Затем вымойте микрочипы с помощью PBS BSA. Чтобы предотвратить неспецифическое связывание миметического антитела, инкубировать микрочипы с PBS BSA GS в течение пяти минут. Затем с 200 наномолярными антителами миметическими в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе.
Чтобы удалить графен PMMA из полимера, пипетка несколько капель воды на полимере вокруг графена PMMA. Затем погрузите его в воду с углом от 30 до 45 градусов, чтобы освободить графен PMMA. Чтобы вытравить медные загрязняющие вещества, подготовьте 50 миллилитровый раствор 0,42 молярного персульфата натрия в воде.
Используйте стандартный стеклянный слайд для передачи графена PMMA в раствор персульфата натрия с графеной стороной вниз. Графен PMMA будет плавать в верхней части раствора. Оставьте его там на ночь.
На следующий день перенесите графен PMMA из раствора персульфата натрия в чистую воду. Пусть он плавает в воде в течение получаса. Повторите мыть в общей сложности три раза, чтобы удалить все остатки натрия persulfate из графена PMMA.
Затем перенесите графен PMMA на кристалл хлорида натрия. Приготовьте насыщенный раствор хлорида натрия в воде в чашке Петри и перенесите графен PMMA поверх раствора с графеной стороной вниз. Держите кристалл хлорида натрия с помощью пинцета и возьмите плавающий графен PMMA.
Затем держите его вертикально в течение двух минут, чтобы избыток воды вытекать. Дайте ему высохнуть до комнатной температуры в течение 30 минут и выпекать его в духовке при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 20 минут. Полностью удалите воду.
Разогреть ацетон в стеклянной чашке Петри примерно до 50 градусов по Цельсию на горячей тарелке в дымовой капот. Внимательно следите за температурой, чтобы избежать пожара. Погрузите графен PMMA на соль в чашку Петри, наполненную ацетоном, и оставьте ее для растворения PMMA на 30 минут.
Пусть графен на соль воздуха сухой тщательно, прежде чем использовать его для подготовки образца. Вымойте один подготовленный и помеченный микрочип в чистой воде, чтобы удалить остатки соли из буфера и поместить его на фильтровальную бумагу. Клетки должны быть видны как темные пятна.
Используйте лезвие бритвы, чтобы сократить многослойный графен на кристалле хлорида натрия на кусок, который соответствует кремния нитрид окно микрочипа. Удалите графен из кристалла хлорида натрия, окунув его в стакан с водой, наклонив кристалл под углом 45 градусов по отношению к поверхности. Поймать графен с металлической петли с поверхности воды, а затем коснуться верхней поверхности микрочипа с нижней поверхности петли, в результате чего микрочип придерживаться металлической петли.
Графен можно увидеть поверх микрочипа. Под стереомикроскопом используйте фильтровальную бумагу, чтобы удалить оставшуюся воду из микрочипа так, чтобы графен покрывал все клетки в окне нитрида кремния. Поместите микрочип на фильтровальную бумагу с помощью пинцета.
Графен виден как фиолетовый мерцание на микрочипе. Перенесите микрочип из бумаги в отсек чашки Петри. Pipette капли воды в один из свободных отсеков и закрыть крышку, чтобы обеспечить атмосферу, насыщенную водой.
Затем запечатать блюдо отсека парафиновой пленкой и хранить его в холодильнике при четырех градусах по Цельсию. Установите STEM до 200 киловольтной энергии пучка, используя образец выравнивания для размера зонда не менее 0,2 нанометров, регулируя конденсаторные линзы. Установите ток зонда 180 Picoampere и полууголь конвергенции пучка 13,2 миллирадианцев путем вставки диафрагмы.
Установите детектор ADF STEM, открываюющий полуугольный диапазон до 68-280 миллирадианцев, регулируя настройки объектива проектора. Затем установите размер изображения STEM до 2048 к 2048 пикселям, а время обитуемого пикселя до шести микросекунд. Загрузите микрочип с графен-покрытыми клетками в стандартный держатель образца для tem таким образом, что клетки сталкиваются и загрузить держателя в электронный микроскоп.
Приобрети обзорное изображение при увеличении 800 X. Затем определите область интереса и изображение наночастиц квантовой точки на уровне 80 000 X с размером пикселей 1,3 нанометров. Здесь показаны оптимально посеянные клетки.
Окно покрыто, но есть достаточно места, чтобы позволить им сгладить и придерживаться. Когда слишком много клеток было посеяно на микрочипе, не было достаточно места для всех клеток, чтобы придерживаться. Через 24 часа более половины клеток не выровнялись.
Если слишком мало клеток посеяны, кремния нитрид окно будет в конечном итоге с большим пустым пространством после 24 часов. DIC и флуоресценции изображения оптимально посеянных клеток показаны здесь, демонстрируя успешную маркировку HER2. STEM выполнялся на клетках SKBR3 с графеновой покрытием и без покрытия.
Вязаные в 800 X увеличения изображения были изображены на 80000 X.Квантовая точка наночастицы видны как яркие пятна на 50000 X увеличение. Для исследования влияния освещения электронного луча на образец, STEM изображения были приобретены в серии изображений с накапливающейся дозой электрона. Здесь показаны репрезентативные результаты для образцов с покрытием и графеном.
Воздействие нео покрытием образцов привело к появлению на поверхности клеток ярких структур, которые не были появляются ни с одним из образцов с графеном. Среднее относительное изменение расстояния пар частиц оставалось ниже 1,3% для нео покрытием образцов и ниже 0,8% для образцов с покрытием. После этой процедуры, различные виды мембранных белков могут быть изображены на целых клетках с помощью других методов микроскопии.
Этот метод позволяет изображения белков в нетронутой плазменной мембраны, чтобы получить больше информации об организации плазменной мембраны и взаимодействия между белками.
