Agradecemos a Sarah Williams, PhD, de Edanz Group (www.edanzediting.com) por editar un borrador de este manuscrito.

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Jichi y cumplen con las pautas de uso y cuidado de animales experimentales de la Guía para animales de laboratorio de la Universidad Médica de Jichi.
1. Obtención de muestras de riñón de ratones HIGA
NOTA: Los ratones HIGA muestran un fenotipo estable de nefropatía por IgA después de las 25 semanas de edad 8,9,10,11. Los ratones Balb/c deben seleccionarse como grupo control 8,9,10,11. Se obtuvieron ratones HIGA hembra de 25 semanas de edad (n = 10) y ratones Balb/c hembra de 25 semanas de edad (n = 10). Es necesario determinar el número de ratones necesarios para los experimentos de antemano. Este paso requiere aproximadamente 7-8 h para un tamaño de muestra de 10 ratones HIGA y 10 ratones Balb/c.
<ol><li>Prepare estos artículos: ratones HIGA (hembra de 25 semanas de edad), ratones Balb/c (hembras de 25 semanas de edad), aparatos de anestesia por inhalación, isoflurano, lámina de corcho, alfiler, solución salina tamponada con fosfato (PBS), jeringas para inyección, agujas, tijeras quirúrgicas y fórceps.</li>
	<li>Anestesiar un ratón HIGA usando 4%-5% de isoflurano con aparato de anestesia por inhalación y montarlo en posición dorsal en la lámina de corcho usando alfileres. Ajustar la concentración de isoflurano a 2%-3% como dosis de mantenimiento después de la inducción de la anestesia. NOTA: La profundidad de la anestesia se mantiene a un nivel en el que el dolor asociado con el procedimiento invasivo se elimina por completo. En particular, la concentración de isoflurano debe ajustarse al 4-5% cuando se extirpan tejidos como el tórax. La depilación y la pomada para los ojos no son esenciales. No es necesario montar el mouse en una almohadilla térmica si el procedimiento se puede realizar rápidamente.</li>
	<li>Haga una incisión de 3-4 cm en la línea media de la pared abdominal del ratón con tijeras quirúrgicas y fórceps e identifique cuidadosamente ambos lados del riñón.</li>
	<li>Incise las costillas y el diafragma con tijeras quirúrgicas y fórceps para exponer el corazón. Después de incidir la aurícula derecha, inyecte PBS en el ventrículo izquierdo hasta que el color del riñón cambie a amarillo pálido (este procedimiento significa que todo el cuerpo del ratón se perfunde con PBS).</li>
	<li>Cortar la arteria renal, la vena renal y el uréter, y extirpar el riñón. Divida el riñón en trozos de 30 mg para usar en el siguiente paso. NOTA: La patología de la nefropatía por IgA afecta principalmente al glomérulo de la corteza renal (parte externa del riñón). Aunque es difícil distinguir macroscópicamente y completamente la corteza y la médula, es deseable recolectar principalmente la parte externa del riñón. Estas muestras pueden almacenarse a –80 °C durante varios meses.</li>
</ol>2. Purificación del ARN total de muestras renales
NOTA: En este paso, se utiliza el kit de aislamiento de miARN disponible comercialmente para la extracción de ARN total. Además, se utiliza una columna de centrifugado de biopolímeros. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles adicionales. El kit de aislamiento de miARN contiene una columna de espín a base de membrana de sílice, reactivos de lisis a base de fenol/guanidina, tampón de lavado de guanidina/etanol (tampón de lavado 1), tampón de lavado de etanol (tampón de lavado 2) y agua libre de nucleasas. Este paso requiere aproximadamente 3 h para un tamaño de muestra de 10 ratones HIGA y 10 ratones control.
<ol><li>Prepare los siguientes elementos: tubos de recolección de 1.5 o 2.0 ml, etanol al 100%, cloroformo, homogeneizador de silicio, micropipetas, puntas de pipeta, centrífuga, columna de centrifugado de biopolímeros, columna de espín a base de membrana de sílice, reactivos de lisis a base de fenol/guanidina, tampón de lavado de guanidina/etanol (tampón de lavado 1), tampón de lavado de etanol (tampón de lavado 2) y agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Homogeneizar muestras de riñón de 30 mg utilizando un homogeneizador de silicio y 700 μL del reactivo de lisis a base de fenol/guanidina a temperatura ambiente. NOTA: Los miRNAs en la muestra son vulnerables hasta que han sido expuestos al reactivo de lisis a base de fenol/guanidina, por lo que estos pasos deben realizarse con prontitud.</li>
	<li>Transfiera el lisado a la columna de centrifugado de biopolímero y centrifugarlo a 15.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir 140 μL de cloroformo al filtrado y mezclar vigorosamente durante 15 s. Dejar actuar durante 2-3 min, luego centrifugar a 12.000 x g a 4 °C durante 15 min.</li>
	<li>Transfiera suavemente el sobrenadante transparente sin tocar la capa intermedia a un nuevo tubo de recolección y agregue el volumen determinado (ver más abajo) de etanol al 100%. Vórtice durante 5 s. NOTA: Se requiere etanol al 100% a 1,5 veces el volumen del sobrenadante obtenido.</li>
	<li>Transfiera la muestra (límite superior 700 μL) a una columna de centrifugado a base de membrana de sílice y centrifugar la muestra a temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el filtrado después de la centrifugación.</li>
	<li>Añadir 700 μL de tampón de lavado 1 a la columna de centrifugado a base de membrana de sílice y centrifugar la columna a temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el filtrado después de la centrifugación.</li>
	<li>Añadir 500 μL de tampón de lavado 2 a la columna de centrifugado a base de membrana de sílice y centrifugarla a temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el filtrado después de la centrifugación.</li>
	<li>Añadir 500 μL de tampón de lavado 2 a la columna de centrifugado a base de membrana de sílice y centrifugarla a temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el filtrado después de la centrifugación.</li>
	<li>Centrifugar de nuevo la columna de centrifugado a base de membrana de sílice sin añadir nada para eliminar el etanol adicional, a 15.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente. Deseche el filtrado después de la centrifugación.</li>
	<li>Cambie el tubo conectado a la columna de centrifugado por un nuevo tubo de recolección.</li>
	<li>Agregue 30 μL de agua libre de nucleasas a la columna de centrifugado a base de membrana de sílice y centrifugarla a 8,000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente. NOTA: La solución resultante de 30 μL contiene una alta concentración de ARN total. Esta muestra puede almacenarse a –80 °C durante varios meses.</li>
</ol>3. Síntesis de ADNc a partir de ARN total
NOTA: En este paso, se utiliza un kit de transcripción inversa disponible comercialmente. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles adicionales. Este kit contiene mezcla de ácidos nucleicos, mezcla de transcriptasa inversa y tampón. Este procedimiento debe realizarse en hielo para evitar el progreso de la reacción. Este paso requiere aproximadamente 3 h para un tamaño de muestra de 10 ratones HIGA y 10 ratones control.
<ol><li>Prepare los siguientes elementos: tubos de recolección de 1,5 ml, tubos de tira de ocho pocillos, micropipetas, puntas de pipetas, espectrofotómetro, agua libre de nucleasas, hielo, mezcla de ácidos nucleicos, mezcla de transcriptasa inversa, tampón y termociclador.</li>
	<li>Mida la concentración de ARN total usando un espectrofotómetro. Luego, calcule el volumen requerido de agua libre de nucleasas para que 12 μL contengan 1 μg de ARN total.</li>
	<li>Prepare una mezcla maestra con el siguiente contenido: 2.0 μL de mezcla de ácidos nucleicos, 2.0 μL de mezcla de transcriptasa inversa y 4.0 μL de tampón hasta un total de 8.0 μL por muestra.</li>
	<li>Agregue 8 μL de la mezcla maestra a cada pocillo de tubos de tira de ocho pocillos.</li>
	<li>Diluir el ARN total en el volumen de agua libre de nucleasas calculado en 3.2. Luego, agregue 12 μL de la solución de ARN total (que contiene 1 μg de ARN total) a cada pocillo de tubos de tira de ocho pocillos.</li>
	<li>Incubar la muestra en tubos de 8 pocillos a 37 °C durante 60 min utilizando el termociclador. A continuación, incubar a 95 °C durante 5 min utilizando el termociclador. NOTA: La solución después de la incubación contiene una alta concentración de ADNc.</li>
	<li>Transfiera esta solución a un tubo de 1,5 ml y agregue 200 μL de agua libre de nucleasas. NOTA: Los 200 μL de solución resultantes se pueden utilizar para qRT-PCR como ADNc plantilla. Esta muestra puede almacenarse a –80 °C durante aproximadamente 1 año.</li>
</ol>4. qRT-PCR de miRNA
NOTA: En este paso, se utiliza un kit de PCR disponible comercialmente. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles adicionales. Este kit contiene mezcla de PCR, cebador universal y agua libre de nucleasas. Las muestras deben prepararse por duplicado, y la exactitud de los resultados debe considerarse en cada caso. Los niveles de expresión de miRNA se cuantifican mediante el método ΔΔCT. Este paso requiere aproximadamente 4 h para un tamaño de muestra de 10 ratones HIGA y 10 ratones control.
<ol><li>Prepare los siguientes elementos: tubo de recolección de 1,5 ml, placa de reacción de 96 pocillos, película adhesiva para la placa de reacción de 96 pocillos, micropipetas, puntas de pipeta, mezcla de PCR, cebador universal, agua libre de nucleasas, cebadores específicos de miARN y un instrumento de PCR en tiempo real.</li>
	<li>Prepare la mezcla maestra con el siguiente contenido: 12,5 μL de mezcla de PCR, 2,5 μL de cebador universal, 1,25 μL de cebador específico de miARN de 5 μM y 6,25 μL de agua libre de nucleasas para cada pozo. NOTA: En este ensayo, se utilizaron cebadores específicos para miRNAs [ARN, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p y miR-21-5p]. RNU6-2 fue utilizado como control endógeno14.</li>
	<li>Agregue 22.5 μL de la mezcla maestra a cada pocillo de la placa de reacción de 96 pocillos.</li>
	<li>Añadir 2,5 μL de ADNc preparado en el paso 3.7 al pocillo individual de la placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Cubra la placa de reacción de 96 pocillos con una película de adhesión, luego centrifugar a 1.000 x g durante 30 s.</li>
	<li>Ejecute el instrumento de PCR en tiempo real. Programe el instrumento de PCR de la siguiente manera: activación inicial a 95 °C durante 15 min, luego 40 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 15 s, recocido a 55 °C durante 30 s y extensión a 70 °C durante 30 s.</li>
	<li>Cuantificar la expresión génica utilizando el método ΔΔCT. Los niveles de expresión relativos se determinan como 2–ΔΔCT. NOTA: Las curvas de amplificación por PCR anormales deben considerarse para su exclusión de los resultados.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgA+Nephropathy.">IgA Nephropathy.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).</li><li>Szeto, C. C., Li, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+IgA+nephropathy.">MicroRNAs in IgA nephropathy.</a> Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).</li><li>Wyatt, R. J., Julian, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgA+nephropathy.">IgA nephropathy.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).</li><li>Vishnoi, A., Rani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA+Biogenesis+and+Regulation+of+Diseases:+An+Overview.">MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).</li><li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics:+towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases.">MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).</li><li>Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+miR-148b+expression+promotes+aberrant+glycosylation+of+IgA1+in+IgA+nephropathy.">Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).</li><li>Serino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+a+retrospective+international+study,+circulating+miR-148b+and+let-7b+were+found+to+be+serum+markers+for+detecting+primary+IgA+nephropathy.">In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy.</a> Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).</li><li>Muso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+production+of+glomerular+extracellular+matrix+in+a+new+mouse+strain+of+high+serum+IgA+ddY+mice.">Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice.</a> Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).</li><li>Kurano, M., Yatomi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+gas+chromatography+mass+spectrometry+to+elucidate+metabolites+predicting+the+phenotypes+of+IgA+nephropathy+in+hyper+IgA+mice.">Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice.</a> Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).</li><li>Hyun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+improve+renal+function+in+a+mouse+model+of+IgA+nephropathy.">Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy.</a> Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).</li><li>Katsuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+a+mouse+model+of+immunoglobulin+A+nephropathy+reveals+an+enhanced+PDGF-EDG5+cascade.">Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade.</a> The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evidence+based+strategy+for+normalization+of+quantitative+PCR+data+from+miRNA+expression+analysis+in+forensic+organ+tissue+identification.">An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification.</a> Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+miR-146a+and+miR-155+in+kidney+biopsy+and+urine+from+patients+with+IgA+nephropathy.">Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy.</a> Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).</li><li>Hennino, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21-5p+renal+expression+is+associated+with+fibrosis+and+renal+survival+in+patients+with+IgA+nephropathy.">miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy.</a> Scientific Reports. 6, 27209 (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Pudimos medir los niveles de expresión de miRNAs en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía IgA (ratones HIGA) utilizando este nuevo método. La nefropatía por IgA es una enfermedad inexplicable que necesita más investigación para aclarar su etiología y dianas terapéuticas 1,3. Sin embargo, la obtención de muestras de riñón humano es altamente invasiva. Esta nueva técnica es ventajosa porque permite el estudio de la nefropatía por IgA utili...

La nefropatía por inmunoglobulina A (IgA) es un tipo de glomerulonefritis primaria caracterizada por el depósito anormal de IgA en la región mesangial glomerular renal 1,2. Es la más común de las glomerulonefritis primarias y conduce a la insuficiencia renal terminal en 20-40% de los pacientes2. La causa aún se desconoce, pero la infección persistente de la mucosa ha sido implicada 1,3. Los corticosteroides, inmunosupresores e inhibidores del sistema renina-angiotensina han sido propuestos como métodos terapéuticos1,3, pero no han sido completamente establecidos 3. Por lo tanto, se necesita investigación adicional para aclarar la etiología y los métodos terapéuticos para tratar la nefropatía por IgA.
Los microARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes que desempeñan un papel importante en la regulación de la expresión génica 4,5. Se informa que los miARN están involucrados en la patogénesis de diversas enfermedades, y algunos han sido identificados como biomarcadores de enfermedades y agentes terapéuticos 4,5. En los últimos años, también se ha descrito una asociación entre los miRNAs y la patogénesis de la nefropatía por IgA 2,6,7. Por ejemplo, se demostró que miR-148b estaba involucrado en anomalías estructurales de IgA en pacientes con nefropatía por IgA 2,6,7, mientras que miR-148b y let-7b se documentaron como nuevos biomarcadores para detectar la nefropatía por IgA7. Aunque comprender los efectos de los miARN sobre la nefropatía por IgA puede ayudar a dilucidar aún más la etiología y el tratamiento 2, aún no se han establecido métodos estándar para perfilar los miARN en la nefropatía por IgA utilizando modelos de animales pequeños2.
Aquí desarrollamos un método simple y confiable para medir los niveles de expresión de miARN en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía por IgA (ratones HIGA). El ratón HIGA es una cepa ddY característica que muestra un nivel particularmente alto de IgA sérica y el depósito anormal de IgA en los glomérulos renales 8,9,10,11. Por lo tanto, los ratones HIGA se pueden utilizar como un modelo de ratón de nefropatía por IgA 8,9,10,11. Nuestro método consta de cuatro pasos principales: primero, obtener quirúrgicamente muestras de riñón de ratones HIGA; segundo, homogeneizar muestras y purificar el ARN total utilizando una columna de espín basada en membrana de sílice; tercero, sintetizar ADN complementario (ADNc) a partir de ARN total mediante transcripción inversa; y cuarto, detectar los niveles de expresión de miRNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR). La justificación de este método y la fiabilidad de los resultados se basan en informes anteriores12,13. Demostramos que esta es una técnica útil para medir con precisión los niveles de expresión de miARN en un modelo de ratón con nefropatía por IgA, y que podría usarse para facilitar futuras investigaciones sobre miARN en la nefropatía por IgA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BALB/cCrSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>Mouse for control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIGA/NscSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>IgA nephropathy mouse model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Experimental kit for synthesis of cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Experimental kit fot extraction of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (RNU6-2)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-155-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-146a-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001638</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-21-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00009079</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Experimental kit for real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>biopolymer-shredding spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>takara biomasher standard</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>silicon homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of microrna expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice

La nefropatía por inmunoglobulina A (IgA) es un tipo de glomerulonefritis primaria caracterizada por el depósito anormal de IgA, que conduce a la insuficiencia renal terminal. En los últimos años, se ha reportado la participación de microRNAs (miRNAs) en la patogénesis de la nefropatía por IgA. Sin embargo, no existe un método establecido para perfilar miRNAs en la nefropatía por IgA utilizando modelos de animales pequeños. Por lo tanto, desarrollamos un método confiable para analizar miRNA en el riñón de un modelo de ratón IgA (ratón HIGA). El objetivo de este protocolo es detectar los niveles de expresión alterados de miRNAs en los riñones de ratones HIGA en comparación con los niveles en riñones de ratones control. En resumen, este método consta de cuatro pasos: 1) obtención de muestras de riñón de ratones HIGA; 2) purificar el ARN total de muestras de riñón; 3) sintetizar ADN complementario a partir de ARN total; y 4) reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) de miRNAs. Usando este método, detectamos con éxito los niveles de expresión de varios miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p y miR-21-5p) en los riñones de ratones HIGA. Este nuevo método se puede aplicar a otros estudios que perfilan miRNAs en nefropatía por IgA.

Investigamos los niveles de expresión de miRNAs en los riñones de ratones HIGA (n = 10). Este resultado se obtuvo completamente en base al protocolo descrito. Los riñones de ratones Balb/c fueron seleccionados como control (n=10). En ambos grupos, se seleccionaron las 25 semanas de edad. Solo los ratones HIGA hembra estaban disponibles en el proveedor. Los niveles de expresión de tres miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p y miR-21-5p; Figura 1) fueron detectados, que previamente fueron reporta...

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Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

Los microARN están implicados en la patogénesis de la nefropatía por IgA. Hemos desarrollado un método fiable para detectar los niveles de expresión de microARN en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía IgA (ratones HIGA). Este nuevo método facilitará la comprobación de la participación de los miRNAs en la nefropatía por IgA.

Detección de la expresión de microARN en los riñones de ratones nefropáticos de inmunoglobulina A

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

detection-microrna-expression-kidneys-immunoglobulin-nephropathic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

1.8K vistas.  Jichi Medical University. Los microARN están implicados en la patogénesis de la nefropatía por IgA. Hemos desarrollado un método fiable para detectar los niveles de expresión de microARN en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía IgA (ratones HIGA). Este nuevo método facilitará la comprobación de la participación de los miRNAs en la nefropatía por IgA.

Video: Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

La inducción de la hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Investigación

Inmunología e Infección

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Los ensayos cualitativos y cuantitativos para la detección y caracterización de proteínas de antimicrobianos

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3' non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Reglamento basadas en microARN de picornavirus tropismo

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Detección y eliminación de nucleasa contaminación durante la purificación de prototipo recombinante Virus Espumoso integrasa

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a promising future of using miRNAs in the diagnosis and care of lung diseases. Here, we define a protocol for miRNA profiling to measure the relative abundance of a group of miRNAs predicted to regulate inflammatory genes in the lung tissue from of an ozone-induced airway inflammation mouse model. Because it has been shown that circulating sex hormone levels can affect the regulation of lung innate immunity in females, the purpose of this method is to describe an inflammatory miRNA profiling protocol in female mice, taking into consideration the estrous cycle stage of each animal at the time of ozone exposure. We also address applicable bioinformatics approaches to miRNA discovery and target identification methods using limma, an R/Bioconductor software, and functional analysis software to understand the biological context and pathways associated with differential miRNA expression.

Here we describe a method to assess lung expression of miRNAs that are predicted to regulate inflammatory genes using mice exposed to ozone or filtered air at different stages of the estrous cycle.

MicroARN pulmón perfilado a través de la el ciclo estral en ratones expuestos al ozono

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...