Agradecemos a Sarah Williams, PhD, do Edanz Group (www.edanzediting.com) pela edição de um rascunho deste manuscrito.

Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Jichi Medical University e estão em conformidade com as diretrizes de Uso e Cuidado de Animais Experimentais do Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.
1. Obtenção de amostras de rins de camundongos HIGA
NOTA: Camundongos HIGA apresentam fenótipo estável de nefropatia por IgA após 25 semanas de idade 8,9,10,11. Camundongos Balb/c devem ser selecionados como grupo controle 8,9,10,11. Camundongos HIGA fêmeas com 25 semanas de idade (n = 10) e fêmeas Balb/c de 25 semanas de idade (n = 10) foram obtidos. É necessário determinar o número de camundongos necessários para experimentos com antecedência. Esta etapa requer cerca de 7 a 8 h para um tamanho de amostra de 10 camundongos HIGA e 10 camundongos Balb/c.
<ol><li>Prepare estes itens: camundongos HIGA (25 semanas, fêmea), camundongos Balb/c (25 semanas, fêmea), aparelho de anestesia inalatória, isoflurano, folha de cortiça, pino, solução salina tamponada com fosfato (PBS), seringas de injeção, agulhas, tesoura cirúrgica e pinça.</li>
	<li>Anestesiar um rato HIGA utilizando 4%–5% de isoflurano com aparelho de anestesia inalatória e montá-lo na posição dorsal sobre a folha de cortiça com pinos. Ajustar a concentração de isoflurano para 2%–3% como dose de manutenção após a indução da anestesia. NOTA: A profundidade da anestesia é mantida em um nível no qual a dor associada ao procedimento invasivo é completamente eliminada. Em particular, a concentração de isoflurano deve ser ajustada para 4-5% ao excisar tecidos como o tórax. Depilação e pomada ocular não são essenciais. Não é necessário montar o mouse em uma almofada de aquecimento se o procedimento puder ser realizado rapidamente.</li>
	<li>Faça uma incisão de 3 a 4 cm na linha média da parede abdominal do camundongo com tesoura cirúrgica e pinça e identifique cuidadosamente ambos os lados do rim.</li>
	<li>Incisar as costelas e o diafragma com tesoura cirúrgica e pinça para expor o coração. Depois de incisar o átrio direito, injete PBS no ventrículo esquerdo até que a cor do rim mude para amarelo pálido (este procedimento significa que todo o corpo do rato é perfundido com PBS.)</li>
	<li>Corte a artéria renal, a veia renal e o ureter e remova o rim. Divida o rim em pedaços de 30 mg para uso na próxima etapa. NOTA: A patologia da nefropatia por IgA envolve principalmente o glomérulo no córtex renal (parte externa do rim). Embora seja difícil distinguir macroscopicamente e completamente o córtex e a medula, é desejável coletar principalmente a parte externa do rim. Essas amostras podem ser armazenadas a –80 °C por vários meses.</li>
</ol>2. Purificação do RNA total de amostras de rim
NOTA: Nesta etapa, o kit de isolamento de miRNA disponível comercialmente é usado para a extração de RNA total. Além disso, a coluna de spin de trituração de biopolímero é usada. Consulte a Tabela de materiais para obter detalhes adicionais. O kit de isolamento de miRNA contém uma coluna de spin à base de membrana de sílica, reagentes de lise à base de fenol/guanidina, tampão de lavagem de guanidina/etanol (tampão de lavagem 1), tampão de lavagem com etanol (tampão de lavagem 2) e água livre de nuclease. Esta etapa requer cerca de 3 h para um tamanho de amostra de 10 camundongos HIGA e 10 camundongos controle.
<ol><li>Preparar os seguintes itens: tubos coletores de 1,5 ou 2,0 mL, etanol 100%, clorofórmio, homogeneizador de silício, micropipetas, ponteiras de pipeta, centrífuga, coluna de spin trituradora de biopolímero, coluna de spin à base de membrana de sílica, reagentes de lise à base de fenol/guanidina, tampão de lavagem guanidina/etanol (tampão de lavagem 1), tampão de lavagem com etanol (tampão de lavagem 2) e água livre de nuclease.</li>
	<li>Homogeneizar amostras de 30 mg de rim utilizando um homogeneizador de silício e 700 μL do reagente de lise à base de fenol/guanidina à temperatura ambiente. NOTA: Os miRNAs na amostra são vulneráveis até que tenham sido expostos ao reagente de lise à base de fenol/guanidina, portanto, essas etapas devem ser executadas imediatamente.</li>
	<li>Transfira o lisado para a coluna de spin trituradora de biopolímero e centrifuga-o a 15.000 x g por 2 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicionar 140 μL de clorofórmio ao filtrado e misturar vigorosamente durante 15 s. Deixe por 2–3 min, depois centrifugue a 12.000 x g a 4 °C por 15 min.</li>
	<li>Transfira suavemente o sobrenadante transparente sem tocar a camada intermediária para um novo tubo coletor e adicione o volume determinado (veja abaixo) de etanol 100%. Vórtice por 5 s. NOTA: É necessário etanol a 100% a 1,5x o volume do sobrenadante obtido.</li>
	<li>Transferir a amostra (limite superior de 700 μL) para uma coluna de spin à base de membrana de sílica e centrifugar a amostra à temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Eliminar o filtrado após centrifugação.</li>
	<li>Adicionar 700 μL de tampão de lavagem 1 à coluna de spin à base de membrana de sílica e centrifugar a coluna à temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Eliminar o filtrado após centrifugação.</li>
	<li>Adicionar 500 μL de tampão de lavagem 2 à coluna de spin à base de membrana de sílica e centrifugar-a à temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Eliminar o filtrado após centrifugação.</li>
	<li>Adicionar 500 μL de tampão de lavagem 2 à coluna de spin à base de membrana de sílica e centrifugar-a à temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Eliminar o filtrado após centrifugação.</li>
	<li>Centrifugar novamente a coluna de spin à base de membrana de sílica sem adicionar nada para remover qualquer etanol adicional, a 15.000 x g por 1 min à temperatura ambiente. Deite fora o filtrado após a centrifugação.</li>
	<li>Troque o tubo conectado à coluna de rotação para um novo tubo de coleta.</li>
	<li>Adicionar 30 μL de água livre de nucleases à coluna de spin à base de membrana de sílica e centrifugar a 8.000 x g por 1 min à temperatura ambiente. NOTA: A solução resultante de 30 μL contém uma alta concentração de RNA total. Esta amostra pode ser armazenada a –80 °C durante vários meses.</li>
</ol>3. Síntese de cDNA a partir do RNA total
NOTA: Nesta etapa, um kit de transcrição reversa disponível comercialmente é usado. Consulte a Tabela de materiais para obter detalhes adicionais. Este kit contém mistura de ácidos nucleicos, mistura de transcriptase reversa e tampão. Este procedimento deve ser realizado em gelo para evitar o progresso da reação. Esta etapa requer cerca de 3 h para um tamanho de amostra de 10 camundongos HIGA e 10 camundongos controle.
<ol><li>Preparar os seguintes itens: tubos de coleta de 1,5 mL, tubos de tira de oito poços, micropipetas, ponteiras de pipeta, espectrofotômetro, água livre de nucleases, gelo, mistura de ácidos nucleicos, mistura de transcriptase reversa, tampão e termociclador.</li>
	<li>Medir a concentração de RNA total usando um espectrofotômetro. Em seguida, calcule o volume necessário de água livre de nucleases para que 12 μL contenham 1 μg de RNA total.</li>
	<li>Preparar uma mistura principal com os seguintes conteúdos: 2,0 μL de mistura de ácidos nucleicos, 2,0 μL de mistura de transcriptase reversa e 4,0 μL de tampão para um total de 8,0 μL por amostra.</li>
	<li>Adicionar 8 μL da mistura principal a cada poço de tubos de tira de oito poços.</li>
	<li>Diluir o ARN total no volume de água livre de nucleases calculado em 3.2. Em seguida, adicione 12 μL da solução de RNA total (contendo 1 μg de RNA total) a cada poço de tubos de tira de oito poços.</li>
	<li>Incubar a amostra em tubos de tira de 8 poços a 37 °C durante 60 minutos utilizando o termociclador. Em seguida, incubar a 95 °C por 5 min usando o termociclador. NOTA: A solução após incubação contém uma alta concentração de cDNA.</li>
	<li>Transfira esta solução para um tubo de 1,5 ml e adicione 200 μL de água isenta de nucleases. NOTA: Os 200 μL de solução resultantes podem ser usados para qRT-PCR como um modelo de cDNA. Esta amostra pode ser armazenada a –80 °C por cerca de 1 ano.</li>
</ol>4. qRT-PCR de miRNA
NOTA: Nesta etapa, um kit de PCR disponível comercialmente é usado. Consulte a Tabela de materiais para obter detalhes adicionais. Este kit contém mistura de PCR, primer universal e água livre de nuclease. As amostras devem ser preparadas em duplicata e a precisão dos resultados deve ser considerada em cada caso. Os níveis de expressão de miRNA são quantificados pelo método ΔΔCT. Esta etapa requer cerca de 4 h para um tamanho de amostra de 10 camundongos HIGA e 10 camundongos controle.
<ol><li>Prepare os seguintes itens: tubo de coleta de 1,5 mL, placa de reação de 96 poços, filme adesivo para a placa de reação de 96 poços, micropipetas, pontas de pipeta, mistura de PCR, primer universal, água livre de nuclease, primers específicos para miRNA e um instrumento de PCR em tempo real.</li>
	<li>Preparar a mistura mestra com os seguintes conteúdos: 12,5 μL de mistura de PCR, 2,5 μL de primer universal, 1,25 μL de primer específico para miRNA 5 μM e 6,25 μL de água livre de nuclease para cada poço. NOTA: Neste ensaio foram utilizados primers específicos para miRNAs [RNA, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p]. RNU6-2 foi utilizado como controle endógeno14.</li>
	<li>Adicionar 22,5 μL da mistura mestra a cada poço da placa de reação de 96 poços.</li>
	<li>Adicionar 2,5 μL de cDNA preparado na etapa 3.7 ao poço individual da placa de 96 poços.</li>
	<li>Cubra a placa de reação de 96 poços com filme de adesão e, em seguida, centrifugue a 1.000 x g por 30 s.</li>
	<li>Execute o instrumento PCR em tempo real. Programe o instrumento de PCR da seguinte forma: ativação inicial a 95 °C por 15 min, depois 40 ciclos de desnaturação a 94 °C por 15 s, anelamento a 55 °C por 30 s e extensão a 70 °C por 30 s.</li>
	<li>Quantificar a expressão gênica usando o método ΔΔCT. Os níveis relativos de expressão são determinados como 2–ΔΔCT. NOTA: Curvas de amplificação de PCR anormais devem ser consideradas para exclusão dos resultados.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgA+Nephropathy.">IgA Nephropathy.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).</li><li>Szeto, C. C., Li, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+IgA+nephropathy.">MicroRNAs in IgA nephropathy.</a> Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).</li><li>Wyatt, R. J., Julian, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgA+nephropathy.">IgA nephropathy.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).</li><li>Vishnoi, A., Rani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA+Biogenesis+and+Regulation+of+Diseases:+An+Overview.">MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).</li><li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics:+towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases.">MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).</li><li>Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+miR-148b+expression+promotes+aberrant+glycosylation+of+IgA1+in+IgA+nephropathy.">Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).</li><li>Serino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+a+retrospective+international+study,+circulating+miR-148b+and+let-7b+were+found+to+be+serum+markers+for+detecting+primary+IgA+nephropathy.">In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy.</a> Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).</li><li>Muso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+production+of+glomerular+extracellular+matrix+in+a+new+mouse+strain+of+high+serum+IgA+ddY+mice.">Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice.</a> Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).</li><li>Kurano, M., Yatomi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+gas+chromatography+mass+spectrometry+to+elucidate+metabolites+predicting+the+phenotypes+of+IgA+nephropathy+in+hyper+IgA+mice.">Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice.</a> Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).</li><li>Hyun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+improve+renal+function+in+a+mouse+model+of+IgA+nephropathy.">Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy.</a> Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).</li><li>Katsuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+a+mouse+model+of+immunoglobulin+A+nephropathy+reveals+an+enhanced+PDGF-EDG5+cascade.">Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade.</a> The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evidence+based+strategy+for+normalization+of+quantitative+PCR+data+from+miRNA+expression+analysis+in+forensic+organ+tissue+identification.">An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification.</a> Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+miR-146a+and+miR-155+in+kidney+biopsy+and+urine+from+patients+with+IgA+nephropathy.">Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy.</a> Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).</li><li>Hennino, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21-5p+renal+expression+is+associated+with+fibrosis+and+renal+survival+in+patients+with+IgA+nephropathy.">miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy.</a> Scientific Reports. 6, 27209 (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Conseguimos medir os níveis de expressão de miRNAs nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA) usando este novo método. A nefropatia por IgA é uma doença inexplicada que necessita de mais pesquisas para esclarecer sua etiologia e alvosterapêuticos1,3. No entanto, a obtenção de amostras de rim humano é altamente invasiva. Essa nova técnica é vantajosa na medida em que permite o estudo da nefropatia por IgA em pequenos a...

A nefropatia por imunoglobulina A (IgA) é um tipo de glomerulonefrite primária caracterizada pela deposição anormal de IgA na região mesangial glomerular renal 1,2. É a mais comum das glomerulonefrites primárias e leva à insuficiência renal terminal em 20%–40% dos pacientes2. A causa ainda é desconhecida, mas infecção mucosa persistente tem sido implicada 1,3. Corticosteroides, imunossupressores e inibidores do sistema renina−angiotensina têm sido propostos como métodos terapêuticos1,3, mas não estão completamente estabelecidos 3. Portanto, mais pesquisas são necessárias para esclarecer a etiologia e os métodos terapêuticos do tratamento da nefropatia por IgA.
microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes que desempenham um papel importante na regulação da expressão gênica 4,5. Há relatos de que os miRNAs estão envolvidos na patogênese de várias doenças, e alguns têm sido identificados como biomarcadores e agentes terapêuticosda doença4,5. Nos últimos anos, uma associação entre miRNAs e a patogênese da nefropatia por IgA também tem sido relatada 2,6,7. Por exemplo, demonstrou-se que o miR-148b está envolvido em anormalidades estruturais da IgA em pacientes com nefropatia por IgA 2,6,7, enquanto o miR-148b e o let-7b foram documentados como novos biomarcadores para detecção de nefropatia por IgA7. Embora a compreensão dos efeitos dos miRNAs na nefropatia por IgA possa ajudar a elucidar melhor a etiologia e o tratamento 2, métodos padrão para o perfil de miRNAs na nefropatia por IgA usando modelos de pequenos animais ainda não foram estabelecidos2.
Desenvolvemos um método simples e confiável para medir os níveis de expressão de miRNA nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA). O camundongo HIGA é uma cepa ddY característica, apresentando um nível particularmente alto de IgA sérica e deposição anormal de IgA em glomérulos renais 8,9,10,11. Portanto, camundongos HIGA podem ser usados como modelo de nefropatia por IgAem camundongos 8,9,10,11. Nosso método consiste em quatro etapas principais: primeiro, a obtenção cirúrgica de amostras de rim de camundongos HIGA; segundo, homogeneizar amostras e purificar o RNA total usando uma coluna de spin baseada em membrana de sílica; terceiro, sintetizar DNA complementar (cDNA) a partir de RNA total usando transcrição reversa; e quarto, detecção dos níveis de expressão de miRNA por reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR). A justificativa para esse método e a confiabilidade dos resultados são baseadas em relatos anteriores12,13. Mostramos que esta é uma técnica útil para medir com precisão os níveis de expressão de miRNA em um modelo de nefropatia por IgA em camundongos, e que poderia ser usada para facilitar pesquisas futuras sobre miRNAs na nefropatia por IgA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BALB/cCrSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>Mouse for control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIGA/NscSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>IgA nephropathy mouse model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Experimental kit for synthesis of cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Experimental kit fot extraction of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (RNU6-2)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-155-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-146a-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001638</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-21-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00009079</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Experimental kit for real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>biopolymer-shredding spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>takara biomasher standard</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>silicon homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of microrna expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice

A nefropatia por imunoglobulina A (IgA) é um tipo de glomerulonefrite primária caracterizada pela deposição anormal de IgA, levando à insuficiência renal terminal. Nos últimos anos, o envolvimento de microRNAs (miRNAs) tem sido relatado na patogênese da nefropatia por IgA. No entanto, não há um método estabelecido para perfilar miRNAs na nefropatia por IgA usando modelos de pequenos animais. Portanto, desenvolvemos um método confiável para analisar miRNA no rim de um modelo de camundongo IgA (camundongo HIGA). O objetivo deste protocolo é detectar os níveis alterados de expressão de miRNAs nos rins de camundongos HIGA quando comparados com os níveis em rins de camundongos controle. Em resumo, esse método consiste em quatro etapas: 1) obtenção de amostras de rim de camundongos HIGA; 2) purificação do RNA total das amostras de rim; 3) sintetizar DNA complementar a partir de RNA total; e 4) reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) de miRNAs. Usando este método, detectamos com sucesso os níveis de expressão de vários miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p) nos rins de camundongos HIGA. Este novo método pode ser aplicado a outros estudos de perfil de miRNAs na nefropatia por IgA.

Nós investigamos os níveis de expressão de miRNAs nos rins de camundongos HIGA (n=10). Este resultado foi obtido completamente baseado no protocolo descrito. Os rins de camundongos Balb/c foram selecionados como controle (n=10). Em ambos os grupos, foram selecionadas idades de 25 semanas. Apenas camundongos fêmeas HIGA estavam disponíveis no fornecedor. Os níveis de expressão de três miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p; Gráfico 1) foram detectados, os quais foram previamente...

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Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

microRNAs estão envolvidos na patogênese da nefropatia por IgA. Desenvolvemos um método confiável para detectar os níveis de expressão de microRNA nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA). Este novo método facilitará a verificação do envolvimento de miRNAs na nefropatia por IgA.

Detecção da Expressão de MicroRNA nos Rins de Camundongos Nefropáticos com Imunoglobulina A

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

detection-microrna-expression-kidneys-immunoglobulin-nephropathic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

1.8K visualizações.  Jichi Medical University. microRNAs estão envolvidos na patogênese da nefropatia por IgA. Desenvolvemos um método confiável para detectar os níveis de expressão de microRNA nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA). Este novo método facilitará a verificação do envolvimento de miRNAs na nefropatia por IgA.

Vídeo: Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Imunologia e Infecção

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3' non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Regulamento baseada MicroRNA de Picornavirus tropismo

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Deteção e remoção de contaminação de Nuclease durante a purificação do protótipo recombinante vírus espumoso Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

Um método para a medição da função da glândula salivar em ratos

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a promising future of using miRNAs in the diagnosis and care of lung diseases. Here, we define a protocol for miRNA profiling to measure the relative abundance of a group of miRNAs predicted to regulate inflammatory genes in the lung tissue from of an ozone-induced airway inflammation mouse model. Because it has been shown that circulating sex hormone levels can affect the regulation of lung innate immunity in females, the purpose of this method is to describe an inflammatory miRNA profiling protocol in female mice, taking into consideration the estrous cycle stage of each animal at the time of ozone exposure. We also address applicable bioinformatics approaches to miRNA discovery and target identification methods using limma, an R/Bioconductor software, and functional analysis software to understand the biological context and pathways associated with differential miRNA expression.

Here we describe a method to assess lung expression of miRNAs that are predicted to regulate inflammatory genes using mice exposed to ozone or filtered air at different stages of the estrous cycle.

Pulmão microRNA Profiling através do ciclo estral em camundongos expostos de ozônio

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

Deteção de imunoglobulina Antiaquaporina-4 G de soro humano por ensaio baseados em células

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...