Bu makalenin taslağını düzenlediği için Edanz Group'tan (www.edanzediting.com) Dr. Sarah Williams'a teşekkür ederiz.

Hayvan deneyleri, Jichi Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Jichi Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Kılavuzu'ndaki Deney Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı kılavuzlarına uygundur.
1. HIGA farelerinden böbrek örnekleri alınması
NOT: HIGA fareleri, 8,9,10,11 yaşından sonra 25 haftalıktan sonra stabil bir IgA nefropatisi fenotipi gösterir. Balb/c fareler kontrol grubu 8,9,10,11 olarak seçilmelidir. 25 haftalık dişi HIGA fareleri (n = 10) ve 25 haftalık dişi Balb / c fareleri (n = 10) elde edildi. Deneyler için gerekli olan fare sayısını önceden belirlemek gerekir. Bu adım, 10 HIGA faresi ve 10 Balb / c fareden oluşan bir örneklem büyüklüğü için yaklaşık 7-8 saat gerektirir.
<ol><li>Şu öğeleri hazırlayın: HIGA fareleri (25 haftalık, dişi), Balb / c fareleri (25 haftalık, dişi), inhalasyon anestezi aparatı, izofluran, mantar tabakası, pim, fosfat tamponlu salin (PBS), enjeksiyon şırıngaları, iğneler, cerrahi makas ve forseps.</li>
	<li>Bir HIGA faresini inhalasyon anestezi aparatı ile izofluran% 4-5 oranında kullanarak uyuşturun ve pimleri kullanarak mantar tabakası üzerine sırt pozisyonunda monte edin. İzofluran konsantrasyonunu, anestezi indüksiyonundan sonra idame dozu olarak% 2-3'e ayarlayın. NOT: Anestezinin derinliği, invaziv prosedürle ilişkili ağrının tamamen ortadan kaldırıldığı bir seviyede tutulur. Özellikle, toraks gibi dokuları eksize ederken izofluran konsantrasyonu% 4-5'e ayarlanmalıdır. Epilasyon ve göz merhemi gerekli değildir. İşlem hızlı bir şekilde gerçekleştirilebiliyorsa, fareyi bir ısıtma yastığına monte etmek gerekli değildir.</li>
	<li>Cerrahi makas ve forseps ile fare karın duvarının 3-4 cm'lik bir orta hat insizyonunu yapın ve böbreğin her iki tarafını dikkatlice tanımlayın.</li>
	<li>Kalbi açığa çıkarmak için kaburgaları ve diyaframı cerrahi makas ve forseps ile kesin. Sağ atriyumu kestikten sonra, böbrek rengi soluk sarıya dönüşene kadar PBS'yi sol ventriküle enjekte edin (bu prosedür, farenin tüm vücudunun PBS ile perfüze edildiği anlamına gelir.)</li>
	<li>Renal arteri, böbrek damarını ve üreteri kesin ve böbreği çıkarın. Bir sonraki adımda kullanmak için böbreği 30 mg'lık parçalara bölün. NOT: IgA nefropatisinin patolojisi esas olarak renal korteksteki (böbreğin dış kısmı) glomerulusu içerir. Korteks ve medullayı makroskopik olarak ve tamamen ayırt etmek zor olsa da, esas olarak böbreğin dış kısmının toplanması arzu edilir. Bu numuneler birkaç ay boyunca –80 °C'de saklanabilir.</li>
</ol>2. Toplam RNA'nın böbrek örneklerinden arındırılması
NOT: Bu adımda, toplam RNA'nın ekstraksiyonu için ticari olarak temin edilebilen miRNA izolasyon kiti kullanılmaktadır. Ek olarak, biyopolimer parçalama spin sütunu kullanılır. Ek ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın. miRNA izolasyon kiti, silika membran bazlı spin kolonu, fenol/guanidin bazlı lizis reaktifleri, guanidin/etanol yıkama tamponu (yıkama tamponu 1), etanol yıkama tamponu (yıkama tamponu 2) ve nükleaz içermeyen su içerir. Bu adım, 10 HIGA faresi ve 10 kontrol faresinden oluşan bir örnek boyutu için yaklaşık 3 saat gerektirir.
<ol><li>Aşağıdaki öğeleri hazırlayın: 1,5 veya 2,0 mL toplama tüpleri, %100 etanol, kloroform, silikon homojenizatör, mikropipetler, pipet uçları, santrifüj, biyopolimer parçalama spin kolonu, silika membran bazlı spin kolonu, fenol/guanidin bazlı lizis reaktifleri, guanidin/etanol yıkama tamponu (yıkama tamponu 1), etanol yıkama tamponu (yıkama tamponu 2) ve nükleaz içermeyen su.</li>
	<li>Oda sıcaklığında bir silikon homojenizatör ve 700 μL fenol/guanidin bazlı lizis reaktifi kullanarak 30 mg böbrek numunelerini homojenize edin. NOT: Numunedeki miRNA'lar, fenol / guanidin bazlı lizis reaktifine maruz kalana kadar savunmasızdır, bu nedenle bu adımlar derhal gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>Lizatı biyopolimer parçalama spin kolonuna aktarın ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 15.000 x g'de santrifüjleyin.</li>
	<li>Filtrelemeye 140 μL kloroform ekleyin ve 15 s boyunca kuvvetlice karıştırın. 2-3 dakika bekletin, ardından 15 dakika boyunca 4 ° C'de 12.000 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>Orta tabakaya dokunmadan şeffaf süpernatantı nazikçe yeni bir toplama tüpüne aktarın ve% 100 etanolün belirlenen hacmini (aşağıya bakınız) ekleyin. 5 s için vorteks. NOT: Elde edilen süpernatantın hacminin 1.5 katında% 100 etanol gereklidir.</li>
	<li>Numuneyi (üst sınır 700 μL) silika membran bazlı bir spin kolonuna aktarın ve numuneyi oda sıcaklığında 8.000 x g'de 15 sn santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra filtratı atın.</li>
	<li>Silika membran bazlı sıkma kolonuna 700 μL yıkama tamponu 1 ekleyin ve kolonu oda sıcaklığında 8.000 x g'de 15 sn santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra filtratı atın.</li>
	<li>Silika membran bazlı sıkma kolonuna 500 μL yıkama tamponu 2 ekleyin ve oda sıcaklığında 8.000 x g'de 15 sn santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra filtratı atın.</li>
	<li>Silika membran bazlı sıkma kolonuna 500 μL yıkama tamponu 2 ekleyin ve oda sıcaklığında 8.000 x g'de 15 sn santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra filtratı atın.</li>
	<li>Silika membran bazlı spin kolonunu, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 15.000 x g'de herhangi bir ek etanol çıkarmak için hiçbir şey eklemeden tekrar santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra filtratı atın.</li>
	<li>Sıkma sütununa bağlı tüpü yeni bir toplama tüpüne değiştirin.</li>
	<li>Silika membran bazlı spin kolonuna 30 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj edin. NOT: Elde edilen 30 μL çözelti, yüksek konsantrasyonda toplam RNA içerir. Bu numune birkaç ay boyunca –80 °C'de saklanabilir.</li>
</ol>3. Toplam RNA'dan cDNA sentezi
NOT: Bu adımda, piyasada satılan bir ters transkripsiyon kiti kullanılır. Ek ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın. Bu kit nükleik asit karışımı, ters transkriptaz karışımı ve tampon içerir. Bu prosedür, reaksiyonun ilerlemesini önlemek için buz üzerinde yapılmalıdır. Bu adım, 10 HIGA faresi ve 10 kontrol faresinden oluşan bir örnek boyutu için yaklaşık 3 saat gerektirir.
<ol><li>Aşağıdaki öğeleri hazırlayın: 1,5 mL toplama tüpleri, sekiz delikli şerit tüpler, mikropipetler, pipet uçları, spektrofotometre, nükleaz içermeyen su, buz, nükleik asit karışımı, ters transkriptaz karışımı, tampon ve termal döngüleyici.</li>
	<li>Bir spektrofotometre kullanarak toplam RNA konsantrasyonunu ölçün. Ardından, 12 μL'nin 1 μg toplam RNA içermesi için gerekli nükleaz içermeyen su hacmini hesaplayın.</li>
	<li>Aşağıdaki içeriklere sahip bir ana karışım hazırlayın: 2,0 μL nükleik asit karışımı, 2,0 μL ters transkriptaz karışımı ve 4,0 μL tampon, numune başına toplam 8,0 μL.</li>
	<li>Sekiz delikli şerit tüplerin her bir kuyucuğuna 8 μL ana karışım ekleyin.</li>
	<li>Toplam RNA'yı, 3.2'de hesaplanan nükleaz içermeyen su hacminde seyreltin. Daha sonra, sekiz delikli şerit tüplerin her bir kuyucuğuna toplam RNA çözeltisinin 12 μL'sini (toplam RNA'nın 1 μg'sini içeren) ekleyin.</li>
	<li>Termal döngüleyiciyi kullanarak numuneyi 37 ° C'de 8 kuyucuklu şerit tüplerde 60 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, termal döngüleyiciyi kullanarak 5 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin. NOT: İnkübasyondan sonraki çözelti yüksek konsantrasyonda cDNA içerir.</li>
	<li>Bu çözeltiyi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 200 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. NOT: Elde edilen 200 μL çözelti, qRT-PCR için şablon cDNA olarak kullanılabilir. Bu numune –80 °C'de yaklaşık 1 yıl saklanabilir.</li>
</ol>4. miRNA'nın qRT-PCR'si
NOT: Bu adımda, piyasada satılan bir PCR kiti kullanılır. Ek ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın. Bu kit PCR karışımı, üniversal astar ve nükleaz içermeyen su içerir. Numuneler çift olarak hazırlanmalı ve sonuçların doğruluğu her durumda dikkate alınmalıdır. MiRNA'nın ekspresyon seviyeleri ΔΔCT yöntemi ile ölçülür. Bu adım, 10 HIGA faresi ve 10 kontrol faresinden oluşan bir örneklem büyüklüğü için yaklaşık 4 saat gerektirir.
<ol><li>Aşağıdaki öğeleri hazırlayın: 1,5 mL toplama tüpü, 96 delikli reaksiyon plakası, 96 delikli reaksiyon plakası için yapışkan film, mikropipetler, pipet uçları, PCR karışımı, üniversal astar, nükleaz içermeyen su, miRNA'ya özgü primerler ve gerçek zamanlı PCR cihazı.</li>
	<li>Ana karışımı aşağıdaki içeriklerle hazırlayın: 12,5 μL PCR karışımı, 2,5 μL üniversal astar, 1,25 μL 5 μM miRNA'ya özgü astar ve her bir kuyucuk için 6,25 μL nükleaz içermeyen su. NOT: Bu tahlilde miRNA'lara özgü primerler [RNA, U6 Küçük Nükleer 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p ve miR-21-5p] kullanılmıştır. RNU6-2 endojen kontrol14 olarak kullanıldı.</li>
	<li>96 kuyucuklu reaksiyon plakasının her bir kuyucuğuna 22,5 μL ana karışım ekleyin.</li>
	<li>Adım 3.7'de hazırlanan 2.5 μL cDNA'yı 96 kuyucuk plakasının bireysel kuyucuğuna ekleyin.</li>
	<li>96 kuyucuklu reaksiyon plakasını yapışma filmi ile örtün, ardından 30 sn boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>Gerçek zamanlı PCR cihazını çalıştırın. PCR cihazını şu şekilde programlayın: 15 dakika boyunca 95 ° C'de ilk aktivasyon, daha sonra 15 s için 94 ° C'de 40 döngü denatürasyon, 30 s için 55 ° C'de tavlama ve 30 s için 70 ° C'de uzatma.</li>
	<li>ΔΔCT yöntemini kullanarak gen ekspresyonunu sayısallaştırın. Göreli ekspresyon seviyeleri 2–ΔΔCT olarak belirlenir. NOT: Sonuçlardan dışlamak için anormal PCR amplifikasyon eğrileri dikkate alınmalıdır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgA+Nephropathy.">IgA Nephropathy.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).</li><li>Szeto, C. C., Li, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+IgA+nephropathy.">MicroRNAs in IgA nephropathy.</a> Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).</li><li>Wyatt, R. J., Julian, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgA+nephropathy.">IgA nephropathy.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).</li><li>Vishnoi, A., Rani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA+Biogenesis+and+Regulation+of+Diseases:+An+Overview.">MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).</li><li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics:+towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases.">MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).</li><li>Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+miR-148b+expression+promotes+aberrant+glycosylation+of+IgA1+in+IgA+nephropathy.">Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).</li><li>Serino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+a+retrospective+international+study,+circulating+miR-148b+and+let-7b+were+found+to+be+serum+markers+for+detecting+primary+IgA+nephropathy.">In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy.</a> Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).</li><li>Muso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+production+of+glomerular+extracellular+matrix+in+a+new+mouse+strain+of+high+serum+IgA+ddY+mice.">Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice.</a> Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).</li><li>Kurano, M., Yatomi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+gas+chromatography+mass+spectrometry+to+elucidate+metabolites+predicting+the+phenotypes+of+IgA+nephropathy+in+hyper+IgA+mice.">Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice.</a> Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).</li><li>Hyun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+improve+renal+function+in+a+mouse+model+of+IgA+nephropathy.">Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy.</a> Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).</li><li>Katsuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+a+mouse+model+of+immunoglobulin+A+nephropathy+reveals+an+enhanced+PDGF-EDG5+cascade.">Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade.</a> The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evidence+based+strategy+for+normalization+of+quantitative+PCR+data+from+miRNA+expression+analysis+in+forensic+organ+tissue+identification.">An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification.</a> Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+miR-146a+and+miR-155+in+kidney+biopsy+and+urine+from+patients+with+IgA+nephropathy.">Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy.</a> Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).</li><li>Hennino, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21-5p+renal+expression+is+associated+with+fibrosis+and+renal+survival+in+patients+with+IgA+nephropathy.">miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy.</a> Scientific Reports. 6, 27209 (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu yeni yöntemi kullanarak bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki miRNA'ların ekspresyon seviyelerini ölçebildik. IgA nefropatisi, etiyolojisini ve terapötik hedeflerini açıklığa kavuşturmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyan açıklanamayan bir hastalıktır 1,3. Bununla birlikte, insan böbrek örneklerinin elde edilmesi oldukça invazivdir. Bu yeni teknik, küçük hayvanlar kullanılarak IgA nefropatisinin incel...

İmmünoglobulin A (IgA) nefropatisi, renal glomerüler mezangial bölgede anormal IgA birikimi ile karakterize bir primer glomerülonefrit türüdür 1,2. Primer glomerülonefritin en sık görülenidir ve hastaların% 20-40'ında son dönem böbrek yetmezliğine yol açar2. Nedeni hala bilinmemekle birlikte kalıcı mukozal enfeksiyon 1,3 ile ilişkilendirilmiştir. Kortikosteroidler, immünsüpresanlar ve renin-anjiyotensin sistemi inhibitörleri terapötik yöntemler olarak önerilmiştir1,3, ancak tam olarak belirlenememiştir3. Bu nedenle, IgA nefropatisinin etiyolojisini ve tedavi yöntemlerini açıklığa kavuşturmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
mikroRNA'lar (miRNA'lar), gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynayan küçük, kodlamayan RNA'lardır 4,5. miRNA'ların çeşitli hastalıkların patogenezinde rol oynadığı bildirilmiştir ve bazıları hastalık biyobelirteçleri ve terapötik ajanlar olarak tanımlanmıştır 4,5. Son yıllarda miRNA'lar ile IgA nefropatisinin patogenezi arasında bir ilişki olduğu da bildirilmiştir 2,6,7. Örneğin, miR-148b'nin IgA nefropatisi 2,6,7 olan hastalarda IgA'nın yapısal anormalliklerine dahil olduğu gösterilirken, miR-148b ve let-7b, IgA nefropatisi 7'yi saptamak için yeni biyobelirteçler olarak belgelenmiştir. MiRNA'ların IgA nefropatisi üzerindeki etkilerini anlamak, etiyolojiyi ve tedaviyi daha fazla aydınlatmaya yardımcı olabilir2, küçük hayvan modelleri kullanılarak IgA nefropatisinde miRNA'ların profilini çıkarmak için standart yöntemler henüz oluşturulmamıştır2.
Burada, bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki miRNA ekspresyon seviyelerini ölçmek için basit ve güvenilir bir yöntem geliştirdik. HIGA faresi, özellikle yüksek serum IgA seviyesini ve böbrek glomerüllerinde anormal IgA birikimini gösteren karakteristik bir ddY suşudur 8,9,10,11. Bu nedenle, HIGA fareleri bir IgA nefropati fare modeli 8,9,10,11 olarak kullanılabilir. Yöntemimiz dört ana adımdan oluşmaktadır: Birincisi, HIGA farelerinden cerrahi olarak böbrek örnekleri elde etmek; ikincisi, numunelerin homojenleştirilmesi ve silika membran bazlı bir spin sütunu kullanılarak toplam RNA'nın saflaştırılması; üçüncüsü, ters transkripsiyon kullanarak toplam RNA'dan tamamlayıcı DNA'nın (cDNA) sentezlenmesi; ve dördüncüsü, kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile miRNA'nın ekspresyon seviyelerinin saptanması. Bu yöntemin gerekçesi ve sonuçların güvenilirliği önceki raporlara dayanmaktadır12,13. Bunun bir IgA nefropatisi fare modelinde miRNA ekspresyon seviyelerini doğru bir şekilde ölçmek için yararlı bir teknik olduğunu ve IgA nefropatisindeki miRNA'lara yönelik gelecekteki araştırmaları kolaylaştırmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BALB/cCrSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>Mouse for control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIGA/NscSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>IgA nephropathy mouse model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Experimental kit for synthesis of cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Experimental kit fot extraction of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (RNU6-2)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-155-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-146a-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001638</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-21-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00009079</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Experimental kit for real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>biopolymer-shredding spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>takara biomasher standard</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>silicon homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of microrna expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice

İmmünoglobulin A (IgA) nefropatisi, IgA'nın anormal birikimi ile karakterize bir primer glomerülonefrit türüdür ve son dönem böbrek yetmezliğine yol açar. Son yıllarda IgA nefropatisinin patogenezinde mikroRNA'ların (miRNA'lar) tutulumu bildirilmiştir. Bununla birlikte, küçük hayvan modelleri kullanılarak IgA nefropatisinde miRNA'ların profilini çıkarmak için belirlenmiş bir yöntem yoktur. Bu nedenle, bir IgA fare modelinin (HIGA fare) böbreğindeki miRNA'yı analiz etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu protokolün amacı, HIGA farelerinin böbreklerindeki miRNA'ların değişmiş ekspresyon seviyelerini, kontrol farelerinin böbreklerindeki seviyelerle karşılaştırıldığında tespit etmektir. Kısacası, bu yöntem dört adımdan oluşur: 1) HIGA farelerinden böbrek örnekleri almak; 2) böbrek örneklerinden toplam RNA'nın saflaştırılması; 3) toplam RNA'dan tamamlayıcı DNA'nın sentezlenmesi; ve 4) miRNA'ların kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR). Bu yöntemi kullanarak, HIGA farelerinin böbreklerindeki birkaç miRNA'nın (miR-155-5p, miR-146a-5p ve miR-21-5p) ekspresyon seviyelerini başarıyla tespit ettik. Bu yeni yöntem, IgA nefropatisinde miRNA'ların profilini çıkaran diğer çalışmalara uygulanabilir.

HIGA farelerinin böbreklerindeki miRNA'ların ekspresyon düzeyleri araştırıldı (n=10). Bu sonuç tamamen tarif edilen protokole dayanarak elde edildi. Kontrol olarak Balb/c farelerin böbrekleri seçildi (n=10). Her iki grupta da 25 haftalık yaş seçildi. Tedarikçiden sadece dişi HIGA fareleri temin edilebiliyordu. Üç miRNA'nın ekspresyon seviyeleri (miR-155-5p, miR-146a-5p ve miR-21-5p; Şekil 1) daha önce IgA nefropatisi ile ilişkili olduğu bildirilen15,16...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice at JoVE.com

Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

mikroRNA'lar IgA nefropatisinin patogenezinde rol oynarlar. Bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki mikroRNA ekspresyon seviyelerini tespit etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu yeni yöntem, IgA nefropatisinde miRNA tutulumunu kontrol etmeyi kolaylaştıracaktır.

İmmünoglobulin A Nefropatik Farelerin Böbreklerinde MikroRNA Ekspresyonunun Tespiti

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

detection-microrna-expression-kidneys-immunoglobulin-nephropathic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

1.8K Görüntüleme.  Jichi Medical University. mikroRNA'lar IgA nefropatisinin patogenezinde rol oynarlar. Bir IgA nefropati fare modelinin (HIGA fareleri) böbreklerindeki mikroRNA ekspresyon seviyelerini tespit etmek için güvenilir bir yöntem geliştirdik. Bu yeni yöntem, IgA nefropatisinde miRNA tutulumunu kontrol etmeyi kolaylaştıracaktır.

Video: Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

SJL Farelerde Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

Farelerde Yerel Anafilaksi Ölçme

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3' non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Picornavirüs tropizm MicroRNA tabanlı Yönetmelik

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Algılama ve kaldırma nükleaz kirlenme rekombinant prototip köpüklü virüs Integrase saflaştırılması sırasında

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

Tükürük bezi işlevi farelerde ölçülmesi için bir yöntem

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a promising future of using miRNAs in the diagnosis and care of lung diseases. Here, we define a protocol for miRNA profiling to measure the relative abundance of a group of miRNAs predicted to regulate inflammatory genes in the lung tissue from of an ozone-induced airway inflammation mouse model. Because it has been shown that circulating sex hormone levels can affect the regulation of lung innate immunity in females, the purpose of this method is to describe an inflammatory miRNA profiling protocol in female mice, taking into consideration the estrous cycle stage of each animal at the time of ozone exposure. We also address applicable bioinformatics approaches to miRNA discovery and target identification methods using limma, an R/Bioconductor software, and functional analysis software to understand the biological context and pathways associated with differential miRNA expression.

Here we describe a method to assess lung expression of miRNAs that are predicted to regulate inflammatory genes using mice exposed to ozone or filtered air at different stages of the estrous cycle.

İmmünoglobulin A Nefropatik Farelerin Böbreklerinde MikroRNA Ekspresyonunun Tespiti

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler