이 원고의 초안을 편집해 주신 Edanz Group(www.edanzediting.com)의 Sarah Williams 박사에게 감사드립니다.

동물 실험은 Jichi Medical University의 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며 Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals의 실험 동물 사용 및 관리 지침을 준수합니다.
1. HIGA 마우스에서 신장 샘플 채취
참고: HIGA 마우스는 생후25주 후에 IgA 신병증의 안정적인 표현형을 나타낸다 8,9,10,11. Balb/c 마우스는 대조군 8,9,10,11로 선택해야 합니다. 25주령의 암컷 HIGA 마우스(n=10)와 25주령의 암컷 Balb/c 마우스(n=10)를 얻었다. 실험에 필요한 마우스의 수를 미리 결정할 필요가 있습니다. 이 단계는 10 마리의 HIGA 마우스와 10 마리의 Balb / c 마우스의 샘플 크기에 대해 약 7-8 시간이 필요합니다.
<ol><li>HIGA 마우스(25주령, 암컷), Balb/c 마우스(25주령, 암컷), 흡입 마취 장치, 이소플루란, 코르크 시트, 핀, 인산염 완충 식염수(PBS), 주사 주사기, 바늘, 수술용 가위 및 겸자.</li>
	<li>흡입 마취 장치와 함께 4%-5%의 이소플루란을 사용하여 HIGA 마우스를 마취하고 핀을 사용하여 코르크 시트의 등쪽 위치에 장착합니다. 마취 유도 후 유지 용량으로 이소플루란의 농도를 2%-3%로 조정합니다. 참고: 마취 깊이는 침습적 시술과 관련된 통증이 완전히 제거되는 수준으로 유지됩니다. 특히, 이소플루란 농도는 흉부와 같은 조직을 절제할 때 4-5%로 조정되어야 합니다. 제모와 눈 연고는 필수적이지 않습니다. 절차를 신속하게 수행 할 수있는 경우 가열 패드에 마우스를 장착 할 필요가 없습니다.</li>
	<li>수술 용 가위와 집게로 마우스 복벽의 정중선을 3-4cm 절개하고 신장의 양쪽을 조심스럽게 확인하십시오.</li>
	<li>수술용 가위와 집게로 갈비뼈와 횡격막을 절개하여 심장을 노출시킵니다. 우심방을 절개한 후 신장색이 옅은 노란색으로 바뀔 때까지 PBS를 좌심실에 주입합니다(이 절차는 마우스의 전신에 PBS가 관류됨을 의미합니다).</li>
	<li>신장 동맥, 신장 정맥 및 요관을 절단하고 신장을 제거하십시오. 다음 단계에서 사용하기 위해 신장을 30mg 조각으로 나눕니다. 참고: IgA 신병증의 병리학은 주로 신장 피질(신장 바깥 부분)의 사구체를 침범합니다. 피질과 수질을 거시적으로 완전히 구별하는 것은 어렵지만 주로 신장의 바깥 부분을 수집하는 것이 바람직합니다. 이 샘플은 –80°C에서 몇 개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 신장 샘플에서 총 RNA 정제
참고: 이 단계에서는 시중에서 판매되는 miRNA 분리 키트를 사용하여 총 RNA를 추출합니다. 또한, 바이오폴리머-파쇄 스핀 컬럼이 사용된다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. miRNA 분리 키트에는 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼, 페놀/구아니딘 기반 용해 시약, 구아니딘/에탄올 세척 완충액(세척 완충액 1), 에탄올 세척 완충액(세척 완충액 2) 및 뉴클레아제가 없는 물이 포함되어 있습니다. 이 단계는 10마리의 HIGA 마우스와 10마리의 대조군 마우스의 샘플 크기에 대해 약 3시간이 필요합니다.
<ol><li>1.5 또는 2.0mL 수집 튜브, 100% 에탄올, 클로로포름, 실리콘 균질화기, 마이크로피펫, 피펫 팁, 원심분리기, 바이오폴리머 파쇄 스핀 컬럼, 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼, 페놀/구아니딘 기반 용해 시약, 구아니딘/에탄올 세척 완충액(세척 완충액 1), 에탄올 세척 완충액(세척 완충액 2) 및 뉴클레아제가 없는 물.</li>
	<li>실온에서 실리콘 균질화기와 700μL의 페놀/구아니딘 기반 용해 시약을 사용하여 30mg 신장 샘플을 균질화합니다. 참고: 샘플의 miRNA는 페놀/구아니딘 기반 용해 시약에 노출될 때까지 취약하므로 이러한 단계를 즉시 수행해야 합니다.</li>
	<li>용해물을 바이오폴리머 파쇄 스핀 컬럼으로 옮기고 실온에서 2분 동안 15,000 x g 에서 원심분리합니다.</li>
	<li>여과액에 클로로포름 140μL를 넣고 15초 동안 세게 혼합합니다. 2-3분 동안 그대로 둔 다음 4°C에서 12,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>중간층을 건드리지 않고 맑은 상청액을 새 수집 튜브로 부드럽게 옮기고 결정된 부피(아래 참조)를 100% 에탄올에 추가합니다. 5 초 동안 소용돌이. 참고 : 얻은 상청액 부피의 1.5 배에서 100 % 에탄올이 필요합니다.</li>
	<li>시료(상한 700μL)를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼으로 옮기고 시료를 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.</li>
	<li>700 μL의 세척 완충액 1을 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 첨가하고 컬럼을 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.</li>
	<li>세척 완충액 2 500μL를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 넣고 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.</li>
	<li>세척 완충액 2 500μL를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 넣고 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.</li>
	<li>실리카 멤브레인 기반의 스핀 컬럼을 다시 원심분리하여 에탄올을 추가로 제거하고, 실온에서 1분 동안 15,000 x g 에서 별도의 에탄올을 제거한다. 원심분리 후 여과액을 버리십시오.</li>
	<li>스핀 컬럼에 부착된 튜브를 새 수집 튜브로 변경합니다.</li>
	<li>뉴클레아제가 없는 물 30μL를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 추가하고 실온에서 1분 동안 8,000 x g 에서 원심분리합니다. 참고: 생성된 30μL 용액에는 고농도의 총 RNA가 포함되어 있습니다. 이 샘플은 -80°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 전체 RNA에서 cDNA 합성
참고: 이 단계에서는 시판되는 역전사 키트가 사용됩니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 이 키트에는 핵산 혼합물, 역전사효소 혼합물 및 완충액이 포함되어 있습니다. 이 절차는 반응의 진행을 방지하기 위해 얼음 위에서 수행해야 합니다. 이 단계는 10마리의 HIGA 마우스와 10마리의 대조군 마우스의 샘플 크기에 대해 약 3시간이 필요합니다.
<ol><li>다음 항목을 준비합니다: 1.5mL 수집 튜브, 8웰 스트립 튜브, 마이크로피펫, 피펫 팁, 분광 광도계, 뉴클레아제가 없는 물, 얼음, 핵산 혼합물, 역전사효소 혼합물, 완충액 및 열 순환기.</li>
	<li>분광 광도계를 사용하여 총 RNA의 농도를 측정합니다. 그런 다음 뉴클레아제가 없는 물의 필요한 부피를 계산하여 12μL에 1μg의 총 RNA가 포함되도록 합니다.</li>
	<li>다음과 같은 내용으로 마스터 믹스를 준비합니다: 2.0 μL의 핵산 혼합물, 2.0 μL의 역전사효소 혼합물 및 4.0 μL의 완충액을 총 8.0 μL로 샘플당 추출합니다.</li>
	<li>8μL의 마스터 믹스를 8웰 스트립 튜브의 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>3.2에서 계산된 뉴클레아제가 없는 물의 부피로 총 RNA를 희석합니다. 그런 다음 총 RNA 용액 12μL(총 RNA 1μg 포함)를 8웰 스트립 튜브의 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>열 순환기를 사용하여 37°C에서 60분 동안 8웰 스트립 튜브에서 샘플을 배양합니다. 그런 다음 열 순환기를 사용하여 95°C에서 5분 동안 배양합니다. 참고: 배양 후 용액에는 고농도의 cDNA가 포함되어 있습니다.</li>
	<li>이 용액을 1.5mL 튜브에 옮기고 뉴클레아제가 없는 물 200μL를 추가합니다. 참고: 생성된 200μL 용액은 qRT-PCR에 주형 cDNA로 사용할 수 있습니다. 이 샘플은 –80°C에서 약 1년 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>4. miRNA의 qRT-PCR
참고: 이 단계에서는 시판되는 PCR 키트가 사용됩니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 이 키트에는 PCR 혼합물, 범용 프라이머 및 뉴클레아제가 없는 물이 포함되어 있습니다. 샘플은 이중으로 준비해야하며 각 경우에 결과의 정확성을 고려해야합니다. miRNA의 발현 수준은 ΔΔCT 방법에 의해 정량화된다. 이 단계는 10마리의 HIGA 마우스와 10마리의 대조군 마우스의 샘플 크기에 대해 약 4시간이 필요합니다.
<ol><li>다음 항목을 준비합니다: 1.5mL 수집 튜브, 96웰 반응 플레이트, 96웰 반응 플레이트용 접착 필름, 마이크로피펫, 피펫 팁, PCR 믹스, 범용 프라이머, 뉴클레아제가 없는 물, miRNA 특이적 프라이머 및 Real-Time PCR 기기.</li>
	<li>각 웰에 대해 PCR 믹스 12.5μL, 범용 프라이머 2.5μL, 5μM miRNA 특이적 프라이머 1.25μL, 뉴클레아제가 없는 물 6.25μL의 내용물로 마스터 믹스를 준비합니다. 참고: 이 분석에서는 miRNA[RNA, U6 Small Nuclear 2(RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p 및 miR-21-5p]에 특이적인 프라이머를 사용했습니다. RNU6-2는 내인성 대조군14를 사용하였다.</li>
	<li>22.5 μL의 마스터 믹스를 96 웰 반응 플레이트의 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>단계 3.7에서 제조된 cDNA 2.5μL를 96웰 플레이트의 개별 웰에 추가합니다.</li>
	<li>96웰 반응 플레이트를 접착 필름으로 덮은 다음 1,000 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>Real-Time PCR 기기를 실행합니다. PCR 기기를 다음과 같이 프로그래밍합니다: 95°C에서 15분 동안 초기 활성화, 94°C에서 15초 동안 40회 변성, 55°C에서 30초 동안 어닐링, 70°C에서 30초 동안 연장.</li>
	<li>ΔΔCT 방법을 사용하여 유전자 발현을 정량화합니다. 상대적 발현 수준은 2–ΔΔCT로 결정됩니다. 참고: 비정상적인 PCR 증폭 곡선은 결과에서 제외하는 것을 고려해야 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+improve+renal+function+in+a+mouse+model+of+IgA+nephropathy.">Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy.</a> Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).</li><li>Katsuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+a+mouse+model+of+immunoglobulin+A+nephropathy+reveals+an+enhanced+PDGF-EDG5+cascade.">Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade.</a> The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evidence+based+strategy+for+normalization+of+quantitative+PCR+data+from+miRNA+expression+analysis+in+forensic+organ+tissue+identification.">An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification.</a> Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+miR-146a+and+miR-155+in+kidney+biopsy+and+urine+from+patients+with+IgA+nephropathy.">Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy.</a> Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).</li><li>Hennino, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21-5p+renal+expression+is+associated+with+fibrosis+and+renal+survival+in+patients+with+IgA+nephropathy.">miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy.</a> Scientific Reports. 6, 27209 (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).</li></ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

우리는 이 새로운 방법을 사용하여 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있었습니다. IgA 신병증은 원인 및 치료 목표를 명확히 하기 위해 추가 연구가 필요한 설명할 수 없는 질병이다 1,3. 그러나 인간 신장 샘플을 얻는 것은 매우 침습적입니다. 이 새로운 기술은 작은 동물을 이용한 IgA 신병증의 연구를 가능하게...

면역글로불린 A(IgA) 신병증은 신장 사구체 간질 영역 1,2에 IgA가 비정상적으로 침착되는 것을 특징으로 하는 원발성 사구체신염의 일종입니다. 원발성 사구체신염 중 가장 흔하며 환자의 20%-40%에서 말기 신부전을 유발한다2. 원인은 아직 밝혀지지 않았으나 지속적인 점막 감염이 연루되어 있다 1,3. 코르티코스테로이드, 면역억제제 및 레닌-안지오텐신계 억제제가 치료 방법으로 제안되었으나 1,3 완전히 확립되지는 않았다 3. 따라서 IgA 신증 치료의 병인 및 치료 방법을 명확히 하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
microRNA(miRNA)는 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 작은 비암호화 RNA입니다 4,5. miRNA는 다양한 질병의 발병기전에 관여하는 것으로 보고되어 있으며, 일부는 질병 바이오마커 및 치료제로 확인되고 있다 4,5. 최근에, miRNA와 IgA 신병증의 발병기전 사이의 연관성이 또한 보고되었다 2,6,7. 예를 들어, miR-148b는 IgA 신병증환자에서 IgA의 구조적 이상에 관여하는 것으로 나타났으며, miR-148b 및 let-7b는 IgA 신병증을 검출하기 위한 새로운 바이오마커로 기록되었다7. IgA 신병증에 대한 miRNA의 효과를 이해하면 병인과 치료법을 더 명확히 하는 데 도움이 될 수 있지만2, 소동물 모델을 사용하여 IgA 신증에서 miRNA를 프로파일링하는 표준 방법은 아직 확립되지 않았습니다2.
본 발명자들은 본원에서 IgA 신병증 마우스 모델 (HIGA 마우스)의 신장에서 miRNA 발현 수준을 측정하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 개발하였다. 상기 HIGA 마우스는 특히 높은 수준의 혈청 IgA 및 신장 사구체에 IgA의 비정상적인 침착을 나타내는 특징적인 ddY 균주이다 8,9,10,11. 따라서, HIGA 마우스는 IgA 신증마우스 모델로 8,9,10,11을 사용할 수 있다. 우리의 방법은 네 가지 주요 단계로 구성됩니다 : 첫째, HIGA 마우스에서 외과 적으로 신장 샘플을 채취합니다. 둘째, 실리카 멤브레인 기반의 스핀 컬럼을 이용하여 시료를 균질화하고 전체 RNA를 정제하는 단계; 셋째, 역전사를 사용하여 전체 RNA로부터 상보적 DNA(cDNA)를 합성하는 단계; 넷째, 정량적 역전사 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 통해 miRNA의 발현 수준을 검출하는 것이다. 이 방법의 이론적 근거와 결과의 신뢰성은 이전 보고서12,13을 기반으로합니다. 우리는 이것이 IgA 신병증 마우스 모델에서 miRNA 발현 수준을 정확하게 측정하는 데 유용한 기술이며 IgA 신병증에서 miRNA에 대한 향후 연구를 촉진하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BALB/cCrSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>Mouse for control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIGA/NscSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>IgA nephropathy mouse model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Experimental kit for synthesis of cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Experimental kit fot extraction of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (RNU6-2)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-155-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-146a-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001638</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-21-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00009079</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Experimental kit for real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>biopolymer-shredding spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>takara biomasher standard</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>silicon homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of microrna expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice

면역 글로불린 A (IgA) 신 병증은 IgA의 비정상적인 침착을 특징으로하는 원발성 사구체 신염의 일종으로 말기 신부전을 유발합니다. 최근에, IgA 신병증의 발병기전에서 microRNA(miRNAs)의 관여가 보고되었다. 그러나 작은 동물 모델을 사용하여 IgA 신병증에서 miRNA를 프로파일링하는 확립된 방법은 없습니다. 따라서 IgA 마우스 모델(HIGA mouse)의 신장에서 miRNA를 분석하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜의 목표는 대조군 마우스의 신장 수준과 비교할 때 HIGA 마우스의 신장에서 miRNA의 변경된 발현 수준을 감지하는 것입니다. 간단히 말해서, 이 방법은 4개의 단계로 구성된다: 1) HIGA 마우스로부터 신장 샘플을 얻고; 2) 신장 샘플로부터 총 RNA를 정제하는 단계; 3) 전체 RNA로부터 상보적 DNA를 합성하는 단계; 및 4) miRNA의 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR). 이 방법을 사용하여 HIGA 마우스의 신장에서 여러 miRNA(miR-155-5p, miR-146a-5p 및 miR-21-5p)의 발현 수준을 성공적으로 검출했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에서 miRNA를 프로파일링하는 다른 연구에 적용할 수 있습니다.

우리는 HIGA 마우스(n=10)의 신장에서 miRNA의 발현 수준을 조사했습니다. 이 결과는 설명된 프로토콜에 따라 완전히 얻어졌습니다. Balb/c 마우스의 신장을 대조군으로 선택했습니다(n=10). 두 그룹 모두에서 25주령을 선택했습니다. 암컷 HIGA 마우스만 공급업체에서 구입할 수 있었습니다. 3개의 miRNA(miR-155-5p, miR-146a-5p, 및 miR-21-5p; 그림 1) IgA 신병증과 관련이 있는 것으로 이전에 보?...

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Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

microRNA는 IgA 신병증의 발병기전에 관여합니다. 우리는 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 microRNA 발현 수준을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에 대한 miRNA의 관여를 확인하는 것을 용이하게 할 것입니다.

면역글로불린 A 신병성 마우스의 신장에서 MicroRNA 발현 검출

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

1.8K 조회수.  Jichi Medical University. microRNA는 IgA 신병증의 발병기전에 관여합니다. 우리는 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 microRNA 발현 수준을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에 대한 miRNA의 관여를 확인하는 것을 용이하게 할 것입니다.

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Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

SJL 마우스의 실험적 면역 Hypophysitis의 유도

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

연구

면역학 및 감염병학

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3' non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

피 코르 나 바이러스과의 바이러스 친 화성의 마이크로 RNA-기반 규제

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 Integrase의 정화 동안 Nuclease 오염의 제거

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

쥐에 있는 침 샘 기능의 측정 하는 방법

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a promising future of using miRNAs in the diagnosis and care of lung diseases. Here, we define a protocol for miRNA profiling to measure the relative abundance of a group of miRNAs predicted to regulate inflammatory genes in the lung tissue from of an ozone-induced airway inflammation mouse model. Because it has been shown that circulating sex hormone levels can affect the regulation of lung innate immunity in females, the purpose of this method is to describe an inflammatory miRNA profiling protocol in female mice, taking into consideration the estrous cycle stage of each animal at the time of ozone exposure. We also address applicable bioinformatics approaches to miRNA discovery and target identification methods using limma, an R/Bioconductor software, and functional analysis software to understand the biological context and pathways associated with differential miRNA expression.

Here we describe a method to assess lung expression of miRNAs that are predicted to regulate inflammatory genes using mice exposed to ozone or filtered air at different stages of the estrous cycle.

폐 예측에 관한 프로 파일링 걸쳐 the Estrous 사이클 오존에 노출 된 쥐에

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

세포 기반 분석 결과 의해 인간의 혈 청 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 G 검출

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...