Name: detection of microrna expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice
Uploaded: 2020-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice at JoVE.com

이 원고의 초안을 편집해 주신 Edanz Group(www.edanzediting.com)의 Sarah Williams 박사에게 감사드립니다.

동물 실험은 Jichi Medical University의 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며 Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals의 실험 동물 사용 및 관리 지침을 준수합니다.
1. HIGA 마우스에서 신장 샘플 채취
참고: HIGA 마우스는 생후25주 후에 IgA 신병증의 안정적인 표현형을 나타낸다 8,9,10,11. Balb/c 마우스는 대조군 8,9,10,11로 선택해야 합니다. 25주령의 암컷 HIGA 마우스(n=10)와 25주령의 암컷 Balb/c 마우스(n=10)를 얻었다. 실험에 필요한 마우스의 수를 미리 결정할 필요가 있습니다. 이 단계는 10 마리의 HIGA 마우스와 10 마리의 Balb / c 마우스의 샘플 크기에 대해 약 7-8 시간이 필요합니다.
<ol><li>HIGA 마우스(25주령, 암컷), Balb/c 마우스(25주령, 암컷), 흡입 마취 장치, 이소플루란, 코르크 시트, 핀, 인산염 완충 식염수(PBS), 주사 주사기, 바늘, 수술용 가위 및 겸자.</li>
	<li>흡입 마취 장치와 함께 4%-5%의 이소플루란을 사용하여 HIGA 마우스를 마취하고 핀을 사용하여 코르크 시트의 등쪽 위치에 장착합니다. 마취 유도 후 유지 용량으로 이소플루란의 농도를 2%-3%로 조정합니다. 참고: 마취 깊이는 침습적 시술과 관련된 통증이 완전히 제거되는 수준으로 유지됩니다. 특히, 이소플루란 농도는 흉부와 같은 조직을 절제할 때 4-5%로 조정되어야 합니다. 제모와 눈 연고는 필수적이지 않습니다. 절차를 신속하게 수행 할 수있는 경우 가열 패드에 마우스를 장착 할 필요가 없습니다.</li>
	<li>수술 용 가위와 집게로 마우스 복벽의 정중선을 3-4cm 절개하고 신장의 양쪽을 조심스럽게 확인하십시오.</li>
	<li>수술용 가위와 집게로 갈비뼈와 횡격막을 절개하여 심장을 노출시킵니다. 우심방을 절개한 후 신장색이 옅은 노란색으로 바뀔 때까지 PBS를 좌심실에 주입합니다(이 절차는 마우스의 전신에 PBS가 관류됨을 의미합니다).</li>
	<li>신장 동맥, 신장 정맥 및 요관을 절단하고 신장을 제거하십시오. 다음 단계에서 사용하기 위해 신장을 30mg 조각으로 나눕니다. 참고: IgA 신병증의 병리학은 주로 신장 피질(신장 바깥 부분)의 사구체를 침범합니다. 피질과 수질을 거시적으로 완전히 구별하는 것은 어렵지만 주로 신장의 바깥 부분을 수집하는 것이 바람직합니다. 이 샘플은 –80°C에서 몇 개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 신장 샘플에서 총 RNA 정제
참고: 이 단계에서는 시중에서 판매되는 miRNA 분리 키트를 사용하여 총 RNA를 추출합니다. 또한, 바이오폴리머-파쇄 스핀 컬럼이 사용된다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. miRNA 분리 키트에는 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼, 페놀/구아니딘 기반 용해 시약, 구아니딘/에탄올 세척 완충액(세척 완충액 1), 에탄올 세척 완충액(세척 완충액 2) 및 뉴클레아제가 없는 물이 포함되어 있습니다. 이 단계는 10마리의 HIGA 마우스와 10마리의 대조군 마우스의 샘플 크기에 대해 약 3시간이 필요합니다.
<ol><li>1.5 또는 2.0mL 수집 튜브, 100% 에탄올, 클로로포름, 실리콘 균질화기, 마이크로피펫, 피펫 팁, 원심분리기, 바이오폴리머 파쇄 스핀 컬럼, 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼, 페놀/구아니딘 기반 용해 시약, 구아니딘/에탄올 세척 완충액(세척 완충액 1), 에탄올 세척 완충액(세척 완충액 2) 및 뉴클레아제가 없는 물.</li>
	<li>실온에서 실리콘 균질화기와 700μL의 페놀/구아니딘 기반 용해 시약을 사용하여 30mg 신장 샘플을 균질화합니다. 참고: 샘플의 miRNA는 페놀/구아니딘 기반 용해 시약에 노출될 때까지 취약하므로 이러한 단계를 즉시 수행해야 합니다.</li>
	<li>용해물을 바이오폴리머 파쇄 스핀 컬럼으로 옮기고 실온에서 2분 동안 15,000 x g 에서 원심분리합니다.</li>
	<li>여과액에 클로로포름 140μL를 넣고 15초 동안 세게 혼합합니다. 2-3분 동안 그대로 둔 다음 4°C에서 12,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>중간층을 건드리지 않고 맑은 상청액을 새 수집 튜브로 부드럽게 옮기고 결정된 부피(아래 참조)를 100% 에탄올에 추가합니다. 5 초 동안 소용돌이. 참고 : 얻은 상청액 부피의 1.5 배에서 100 % 에탄올이 필요합니다.</li>
	<li>시료(상한 700μL)를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼으로 옮기고 시료를 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.</li>
	<li>700 μL의 세척 완충액 1을 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 첨가하고 컬럼을 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.</li>
	<li>세척 완충액 2 500μL를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 넣고 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.</li>
	<li>세척 완충액 2 500μL를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 넣고 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.</li>
	<li>실리카 멤브레인 기반의 스핀 컬럼을 다시 원심분리하여 에탄올을 추가로 제거하고, 실온에서 1분 동안 15,000 x g 에서 별도의 에탄올을 제거한다. 원심분리 후 여과액을 버리십시오.</li>
	<li>스핀 컬럼에 부착된 튜브를 새 수집 튜브로 변경합니다.</li>
	<li>뉴클레아제가 없는 물 30μL를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 추가하고 실온에서 1분 동안 8,000 x g 에서 원심분리합니다. 참고: 생성된 30μL 용액에는 고농도의 총 RNA가 포함되어 있습니다. 이 샘플은 -80°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 전체 RNA에서 cDNA 합성
참고: 이 단계에서는 시판되는 역전사 키트가 사용됩니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 이 키트에는 핵산 혼합물, 역전사효소 혼합물 및 완충액이 포함되어 있습니다. 이 절차는 반응의 진행을 방지하기 위해 얼음 위에서 수행해야 합니다. 이 단계는 10마리의 HIGA 마우스와 10마리의 대조군 마우스의 샘플 크기에 대해 약 3시간이 필요합니다.
<ol><li>다음 항목을 준비합니다: 1.5mL 수집 튜브, 8웰 스트립 튜브, 마이크로피펫, 피펫 팁, 분광 광도계, 뉴클레아제가 없는 물, 얼음, 핵산 혼합물, 역전사효소 혼합물, 완충액 및 열 순환기.</li>
	<li>분광 광도계를 사용하여 총 RNA의 농도를 측정합니다. 그런 다음 뉴클레아제가 없는 물의 필요한 부피를 계산하여 12μL에 1μg의 총 RNA가 포함되도록 합니다.</li>
	<li>다음과 같은 내용으로 마스터 믹스를 준비합니다: 2.0 μL의 핵산 혼합물, 2.0 μL의 역전사효소 혼합물 및 4.0 μL의 완충액을 총 8.0 μL로 샘플당 추출합니다.</li>
	<li>8μL의 마스터 믹스를 8웰 스트립 튜브의 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>3.2에서 계산된 뉴클레아제가 없는 물의 부피로 총 RNA를 희석합니다. 그런 다음 총 RNA 용액 12μL(총 RNA 1μg 포함)를 8웰 스트립 튜브의 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>열 순환기를 사용하여 37°C에서 60분 동안 8웰 스트립 튜브에서 샘플을 배양합니다. 그런 다음 열 순환기를 사용하여 95°C에서 5분 동안 배양합니다. 참고: 배양 후 용액에는 고농도의 cDNA가 포함되어 있습니다.</li>
	<li>이 용액을 1.5mL 튜브에 옮기고 뉴클레아제가 없는 물 200μL를 추가합니다. 참고: 생성된 200μL 용액은 qRT-PCR에 주형 cDNA로 사용할 수 있습니다. 이 샘플은 –80°C에서 약 1년 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>4. miRNA의 qRT-PCR
참고: 이 단계에서는 시판되는 PCR 키트가 사용됩니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 이 키트에는 PCR 혼합물, 범용 프라이머 및 뉴클레아제가 없는 물이 포함되어 있습니다. 샘플은 이중으로 준비해야하며 각 경우에 결과의 정확성을 고려해야합니다. miRNA의 발현 수준은 ΔΔCT 방법에 의해 정량화된다. 이 단계는 10마리의 HIGA 마우스와 10마리의 대조군 마우스의 샘플 크기에 대해 약 4시간이 필요합니다.
<ol><li>다음 항목을 준비합니다: 1.5mL 수집 튜브, 96웰 반응 플레이트, 96웰 반응 플레이트용 접착 필름, 마이크로피펫, 피펫 팁, PCR 믹스, 범용 프라이머, 뉴클레아제가 없는 물, miRNA 특이적 프라이머 및 Real-Time PCR 기기.</li>
	<li>각 웰에 대해 PCR 믹스 12.5μL, 범용 프라이머 2.5μL, 5μM miRNA 특이적 프라이머 1.25μL, 뉴클레아제가 없는 물 6.25μL의 내용물로 마스터 믹스를 준비합니다. 참고: 이 분석에서는 miRNA[RNA, U6 Small Nuclear 2(RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p 및 miR-21-5p]에 특이적인 프라이머를 사용했습니다. RNU6-2는 내인성 대조군14를 사용하였다.</li>
	<li>22.5 μL의 마스터 믹스를 96 웰 반응 플레이트의 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>단계 3.7에서 제조된 cDNA 2.5μL를 96웰 플레이트의 개별 웰에 추가합니다.</li>
	<li>96웰 반응 플레이트를 접착 필름으로 덮은 다음 1,000 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>Real-Time PCR 기기를 실행합니다. PCR 기기를 다음과 같이 프로그래밍합니다: 95°C에서 15분 동안 초기 활성화, 94°C에서 15초 동안 40회 변성, 55°C에서 30초 동안 어닐링, 70°C에서 30초 동안 연장.</li>
	<li>ΔΔCT 방법을 사용하여 유전자 발현을 정량화합니다. 상대적 발현 수준은 2–ΔΔCT로 결정됩니다. 참고: 비정상적인 PCR 증폭 곡선은 결과에서 제외하는 것을 고려해야 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21-5p+renal+expression+is+associated+with+fibrosis+and+renal+survival+in+patients+with+IgA+nephropathy.">miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy.</a> Scientific Reports. 6, 27209 (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).</li></ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

우리는 이 새로운 방법을 사용하여 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있었습니다. IgA 신병증은 원인 및 치료 목표를 명확히 하기 위해 추가 연구가 필요한 설명할 수 없는 질병이다 1,3. 그러나 인간 신장 샘플을 얻는 것은 매우 침습적입니다. 이 새로운 기술은 작은 동물을 이용한 IgA 신병증의 연구를 가능하게...

면역글로불린 A(IgA) 신병증은 신장 사구체 간질 영역 1,2에 IgA가 비정상적으로 침착되는 것을 특징으로 하는 원발성 사구체신염의 일종입니다. 원발성 사구체신염 중 가장 흔하며 환자의 20%-40%에서 말기 신부전을 유발한다2. 원인은 아직 밝혀지지 않았으나 지속적인 점막 감염이 연루되어 있다 1,3. 코르티코스테로이드, 면역억제제 및 레닌-안지오텐신계 억제제가 치료 방법으로 제안되었으나 1,3 완전히 확립되지는 않았다 3. 따라서 IgA 신증 치료의 병인 및 치료 방법을 명확히 하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
microRNA(miRNA)는 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 작은 비암호화 RNA입니다 4,5. miRNA는 다양한 질병의 발병기전에 관여하는 것으로 보고되어 있으며, 일부는 질병 바이오마커 및 치료제로 확인되고 있다 4,5. 최근에, miRNA와 IgA 신병증의 발병기전 사이의 연관성이 또한 보고되었다 2,6,7. 예를 들어, miR-148b는 IgA 신병증환자에서 IgA의 구조적 이상에 관여하는 것으로 나타났으며, miR-148b 및 let-7b는 IgA 신병증을 검출하기 위한 새로운 바이오마커로 기록되었다7. IgA 신병증에 대한 miRNA의 효과를 이해하면 병인과 치료법을 더 명확히 하는 데 도움이 될 수 있지만2, 소동물 모델을 사용하여 IgA 신증에서 miRNA를 프로파일링하는 표준 방법은 아직 확립되지 않았습니다2.
본 발명자들은 본원에서 IgA 신병증 마우스 모델 (HIGA 마우스)의 신장에서 miRNA 발현 수준을 측정하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 개발하였다. 상기 HIGA 마우스는 특히 높은 수준의 혈청 IgA 및 신장 사구체에 IgA의 비정상적인 침착을 나타내는 특징적인 ddY 균주이다 8,9,10,11. 따라서, HIGA 마우스는 IgA 신증마우스 모델로 8,9,10,11을 사용할 수 있다. 우리의 방법은 네 가지 주요 단계로 구성됩니다 : 첫째, HIGA 마우스에서 외과 적으로 신장 샘플을 채취합니다. 둘째, 실리카 멤브레인 기반의 스핀 컬럼을 이용하여 시료를 균질화하고 전체 RNA를 정제하는 단계; 셋째, 역전사를 사용하여 전체 RNA로부터 상보적 DNA(cDNA)를 합성하는 단계; 넷째, 정량적 역전사 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 통해 miRNA의 발현 수준을 검출하는 것이다. 이 방법의 이론적 근거와 결과의 신뢰성은 이전 보고서12,13을 기반으로합니다. 우리는 이것이 IgA 신병증 마우스 모델에서 miRNA 발현 수준을 정확하게 측정하는 데 유용한 기술이며 IgA 신병증에서 miRNA에 대한 향후 연구를 촉진하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>BALB/cCrSlc (25-week-old, female)</td><td>Japan SLC, Inc.</td><td>none</td><td>Mouse for control</td></tr><tr><td>HIGA/NscSlc (25-week-old, female)</td><td>Japan SLC, Inc.</td><td>none</td><td>IgA nephropathy mouse model</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>96-well reaction plate</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>adhesive film for 96-well reaction plate</td></tr><tr><td>miScript II RT kit</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Experimental kit for synthesis of cDNA</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Experimental kit fot extraction of total RNA</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay (RNU6-2)</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>miRNA-specific primer</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay (miR-155-5p)</td><td>Qiagen</td><td>MS00001701</td><td>miRNA-specific primer</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay (miR-146a-5p)</td><td>Qiagen</td><td>MS00001638</td><td>miRNA-specific primer</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay (miR-21-5p)</td><td>Qiagen</td><td>MS00009079</td><td>miRNA-specific primer</td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Experimental kit for real-time PCR</td></tr><tr><td>QIA shredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>biopolymer-shredding spin column</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>real-time PCR instrument</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>real-time PCR instrument software</td></tr><tr><td>takara biomasher standard</td><td>Takara Bio</td><td>9790B</td><td>silicon homogenizer</td></tr></tbody></table>

detection of microrna expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice

면역 글로불린 A (IgA) 신 병증은 IgA의 비정상적인 침착을 특징으로하는 원발성 사구체 신염의 일종으로 말기 신부전을 유발합니다. 최근에, IgA 신병증의 발병기전에서 microRNA(miRNAs)의 관여가 보고되었다. 그러나 작은 동물 모델을 사용하여 IgA 신병증에서 miRNA를 프로파일링하는 확립된 방법은 없습니다. 따라서 IgA 마우스 모델(HIGA mouse)의 신장에서 miRNA를 분석하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜의 목표는 대조군 마우스의 신장 수준과 비교할 때 HIGA 마우스의 신장에서 miRNA의 변경된 발현 수준을 감지하는 것입니다. 간단히 말해서, 이 방법은 4개의 단계로 구성된다: 1) HIGA 마우스로부터 신장 샘플을 얻고; 2) 신장 샘플로부터 총 RNA를 정제하는 단계; 3) 전체 RNA로부터 상보적 DNA를 합성하는 단계; 및 4) miRNA의 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR). 이 방법을 사용하여 HIGA 마우스의 신장에서 여러 miRNA(miR-155-5p, miR-146a-5p 및 miR-21-5p)의 발현 수준을 성공적으로 검출했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에서 miRNA를 프로파일링하는 다른 연구에 적용할 수 있습니다.

우리는 HIGA 마우스(n=10)의 신장에서 miRNA의 발현 수준을 조사했습니다. 이 결과는 설명된 프로토콜에 따라 완전히 얻어졌습니다. Balb/c 마우스의 신장을 대조군으로 선택했습니다(n=10). 두 그룹 모두에서 25주령을 선택했습니다. 암컷 HIGA 마우스만 공급업체에서 구입할 수 있었습니다. 3개의 miRNA(miR-155-5p, miR-146a-5p, 및 miR-21-5p; 그림 1) IgA 신병증과 관련이 있는 것으로 이전에 보?...

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Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

microRNA는 IgA 신병증의 발병기전에 관여합니다. 우리는 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 microRNA 발현 수준을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에 대한 miRNA의 관여를 확인하는 것을 용이하게 할 것입니다.

면역글로불린 A 신병성 마우스의 신장에서 MicroRNA 발현 검출

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

1.8K 조회수.  Jichi Medical University. microRNA는 IgA 신병증의 발병기전에 관여합니다. 우리는 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 microRNA 발현 수준을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에 대한 miRNA의 관여를 확인하는 것을 용이하게 할 것입니다.

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Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

SJL 마우스의 실험적 면역 Hypophysitis의 유도

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

연구

면역학 및 감염병학

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been investigated in various organs and tissues in rat. However, standard methods for the purification of miRNAs and detection of their expression in rat peritoneal membrane have not been well established. We have developed an effective and reliable method to purify and quantify miRNAs using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) in rat peritoneal membrane. This protocol consists of four steps: 1) purification of peritoneal membrane sample; 2) purification of total RNA including miRNA from peritoneal membrane sample; 3) reverse transcription of miRNA to produce cDNA; and 4) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, we successfully determined that the expression of six miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327, and miRNA-34a-5p) increased significantly in the peritoneal membrane of a rat peritoneal fibrosis model compared with those in control groups. This protocol can be used to study the profile of miRNA expression in the peritoneal membrane of rats in many pathological conditions.

Here we present a protocol for the detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This method is suitable for studying the microRNA expression profile in rat peritoneal membrane in several pathological conditions.

정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

유전학

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to partially complementary target sites in the 3&#39; untranslated region (UTR) of messenger RNA (mRNA), which reduces the mRNA&#39;s translation and stability. The miRNA expression profiles in various organs and tissues of mice have been investigated, but standard methods for the purification and quantification of miRNA in mouse kidney have not been available. We have established an effective and reliable method for extracting and evaluating miRNA expression in mouse kidney with renal interstitial fibrosis by quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). The protocol required five steps: (1) creation of sham and unilateral ureteral obstruction (UUO) mice; (2) extraction of kidney samples from the UUO mice; (3) extraction of total RNA, which includes miRNA, from the kidney samples; (4) complementary DNA (cDNA) synthesis with reverse transcription from miRNA; and (5) qRT-PCR using the cDNA. Using this protocol, we successfully confirmed that compared to the controls, the expression of miRNA-3070-3p was significantly increased and those of miRNA-7218-5p and miRNA-7219-5p were significantly decreased in the kidneys of a mouse model of renal interstitial fibrosis. This protocol can be used to determine the miRNA expression in the kidneys of mice with UUO.

We describe a method for evaluating the microRNA expression in the kidneys of mice with unilateral ureteral obstruction (UUO) by quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction. This protocol is suitable for studying kidney microRNA expression profiles in mice with UUO and in the context of other pathological conditions.

일방적 인 요원 방해와 마우스 신장에서 microRNA 표현의 정량적 실시간 PCR 평가

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment

MicroRNAs (miRNAs) are small, noncoding RNAs consisting of 21-25 bases. They are not translated into proteins but rather work to impede the functioning of their target messenger RNAs (mRNAs) by destabilizing them and disrupting their translation. Although the miRNA expression profiles in various mouse organs and tissues have been investigated, there have been no standard methods for purifying and quantifying mouse kidney and serum miRNAs. We have established an effective and reliable method for extracting and evaluating the miRNA expression in the serum and kidney of mice with age-dependent renal impairment. 
The method uses quantitative reverse-transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR), and the protocol requires six steps: (1) preparing senescence-accelerated mouse resistance 1 (SAMR1) mice and senescence-accelerated mouse prone (SAMP1) mice; (2) extracting serum samples from these mice; (3) extracting a kidney sample from each mouse; (4) extracting total RNA (including miRNA) from kidney and serum samples from each mouse; (5) the synthesis of complementary DNA (cDNA) with reverse transcription from the miRNA; (6) conducting a qRT-PCR using the cDNA obtained. 
This protocol was used to confirm that, compared to the controls, the expression of miRNA-7218-5p and miRNA-7219-5p was significantly changed in the kidney and serum of a mouse model of age-dependent renal impairment. This protocol also clarified the relationship between the kidney and serum of the mouse model of age-dependent renal impairment. This protocol can be used to determine miRNA expression in the kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment.

We present a method for evaluating microRNA expression in the kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment by quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction.

연령 의존적 신장 장애가 있는 마우스의 신장 및 혈청에서 MicroRNA 발현의 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응 평가

MicroRNAs (miRNAs) are small, noncoding RNAs consisting of 21-25 bases. They are not translated into proteins but rather work to impede the functioning of ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

의학

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

마이크로 RNA<em&gt; 현장에서</em&gt; 포르말린 고정 신장 조직에 대한 하이브리드

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

생물학

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including the kidneys. Under such circumstances, the kidney loses its ability to clean waste from the blood and regulate salt and fluid concentrations, eventually leading to renal failure. Women, particularly those of childbearing age, are diagnosed nine times more often than men. Kidney disease is the leading cause of mortality in SLE patients. The present protocol describes a quick and simple method to measure excreted protein levels in collected urine, tracking lupus progression over time. In addition, an approach to isolate kidney mononuclear cells is provided based on size and density selection to investigate renal infiltration of leukocytes. Furthermore, an immunohistochemical method has been developed to characterize protein deposition in the glomeruli and leukocyte infiltration in the tubulointerstitial space. Together, these methods can help investigate the progression of chronic inflammation associated with the kidneys of lupus-prone MRL/lpr mice.

The present protocol describes a method to track lupus progression in mice. Two additional procedures are presented to characterize lupus nephritis based on cell infiltration and protein deposition in the kidneys.

단백뇨, 백혈구의 신장 침윤 및 루푸스가 발생하기 쉬운 MRL / lpr 마우스에서 단백질의 신장 침착 분석

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

A Quantitative Detection Method for MicroRNAs in the Kidney of an Ischemic Kidney Injury Mouse Model

MicroRNAs (miRNAs) are involved in various disease states and are effective biomarkers for the early diagnosis of diseases and treatment in mice. However, standard protocols for the purification of miRNAs and detection of their expression in the kidneys of acute kidney injury (AKI) mice have not been well established. This study developed an effective and simple protocol to purify and quantify miRNAs in the kidneys of an AKI mouse model induced by renal ischemia-reperfusion using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol comprises five steps: 1) induction of AKI by renal ischemia-reperfusion, 2) harvesting of kidneys, 3) purification of total RNA, including miRNAs, from kidneys, 4) cDNA synthesis by reverse transcription of miRNA, and 5) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, the renal ischemia-reperfusion injury model can be generated with mild to severe forms of AKI. Additionally, if the procedure is followed properly, a consistent AKI model with minimal individual differences can be obtained. This qRT-PCR assay shows a very wide dynamic range and enables the discrimination of mature miRNAs, which can be accurately quantified with high specificity. This protocol can be used to study the miRNA expression profile in AKI kidneys.

This article presents a protocol for detecting microRNA expression in the kidneys of an acute kidney injury mouse model using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This protocol emphasizes an ischemic kidney injury mouse model and the careful extraction of microRNA samples.

MicroRNAs (miRNAs) are involved in various disease states and are effective biomarkers for the early diagnosis of diseases and treatment in mice. However, ...

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by destabilizing and inhibiting their translation in various kidney diseases. Therefore, alternation of miRNA expression by exogenous artificially synthesized miRNA mimics is a potentially useful treatment option for inhibiting the development of many kidney diseases. However, because serum RNAase immediately degrades systematically administered exogenous miRNA mimics in vivo, delivery of miRNA to the kidney remains a challenge. Therefore, vectors that can protect exogenous miRNA mimics from degradation by RNAase and significantly deliver them to the kidney are necessary. Many studies have used viral vectors to deliver exogenous miRNA mimics or inhibitors to the kidney. However, viral vectors may cause an interferon response and/or genetic instability. Therefore, the development of viral vectors is also a hurdle for the clinical use of exogenous miRNA mimics or inhibitors. To overcome these concerns regarding viral vectors, we developed a nonviral vector method to deliver miRNA mimics to the kidney using tail vein injection of polyethylenimine nanoparticles (PEI-NPs), which led to significant overexpression of target miRNAs in several mouse models of kidney disease.

Here, we deliver exogenous artificially synthesized miRNA mimics to the kidney via tail vein injection of a nonviral vector and polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models. This led to significant overexpression of target miRNA in the kidney, resulting in inhibited progression of kidney disease in several mouse models.

여러 신장 질환 마우스 모델에서 폴리에틸레니민 나노입자를 사용하여 신장에 외인성 인공 합성 miRNA 모방체의 전달

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

Unilateral Ureteral Obstruction Model for Investigating Kidney Interstitial Fibrosis

Kidney fibrosis is the final pathological outcome of progressive chronic kidney disease (CKD). The unilateral ureteral obstruction (UUO) model is widely used to elucidate the molecular and cellular mechanisms underlying kidney interstitial fibrosis and to identify potential therapeutic targets. This model is established in mice through surgical ligation of a unilateral ureter, a procedure that is relatively straightforward and easy to perform. However, the UUO mouse model is known to exhibit significant variability and inconsistency, influenced by factors such as mouse strain, age, sex, anesthesia type, duration of surgery, body temperature during the procedure, the operator's surgical skills, feeding conditions, and the overall health status of the mice. Variations in surgical techniques, suture placement, and the duration of obstruction contribute to the variability in outcomes. Additionally, inconsistent sampling of obstructed kidneys further increases variability in the assessment of kidney fibrosis. This study outlines the process of developing the UUO mouse model and evaluating interstitial fibrosis, discusses the technical challenges contributing to the model's unpredictability, and proposes potential solutions. These insights aim to establish a more standardized and universally applicable approach for investigating kidney fibrosis.

This protocol describes a method for inducing unilateral ureteral obstruction (UUO) in mice to study the progression of tissue fibrosis in obstructive nephropathy. It includes surgical procedures, post-operative care, and methods for fibrosis assessment.

Kidney fibrosis is the final pathological outcome of progressive chronic kidney disease (CKD). The unilateral ureteral obstruction (UUO) model is widely ...