Las células CD8+T tienen características distintas en diferentes tejidos, como un ejemplo crítico de tejido no muosco y no linfoide. Es esencial caracterizar directamente las células residentes en el riñón para entender completamente la biología de las células T. Aquí demostraremos nuestro método conveniente para aislar las células CD8+T residentes en el riñón que acomodan el posterior análisis de citometría de flujo.
Este método podría proporcionar información sobre los estudios de efector y memoria cd8 +T células generadas después de las infecciones, así como respuestas autoinmunes. El procedimiento será realizado por el Dr.Chaoyu Ma, un científico de investigación para mi laboratorio. Comience diluyendo el anticuerpo alfa anti CD8 de biotina a 15 microgramos por mililitro en PBS, asegurándose de que haya suficiente para administrar 200 microlitros a cada ratón.
Antes de la inyección, caliente la vena de la cola del ratón con una lámpara de calor superior durante cinco a 10 minutos para dilatarla. Dibuje 200 microlitros de la mezcla de anticuerpos pre diluidas en una jeringa de insulina del calibre 28 y elimine cualquier burbuja de aire moviendo el pistón hacia arriba y hacia abajo. Doblar la aguja para crear un ángulo de 150 grados entre la aguja y la jeringa, biselado, de modo que la aguja esté paralela a la vena de la cola.
Sujeta el ratón con un limitador de roedores y rocía la cola con 70% de etanol para hacer la vena claramente visible. Sostenga la cola en el extremo distal con el pulgar y los dedos medios de la mano no dominante, luego coloque el dedo índice debajo del sitio de inyección. Con la mano dominante inserte la aguja en la vena en paralelo hacia la dirección del corazón e inyecte lentamente 200 microlitros del anticuerpo.
Retire la aguja y comprima suavemente el lugar de inyección hasta que se detenga el sangrado. Después de eutanasiar el ratón, desecté el riñón con tijeras y transfiéralo a un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Deje las muestras sobre hielo hasta su posterior procesamiento.
Preparar platos de seis pozos con tres mililitros de solución de digestión en cada pozo, usando un pozo por ratón, y almacenarlos en hielo. Agregue 300 microlitros de solución de digestión en cada tubo de muestra y picar las muestras de riñón con una tijera de resorte recta. Transfiera las muestras de riñón picadas a las placas de seis pozos con la solución de digestión.
Incubar las muestras a 37 grados centígrados con un suave balanceo durante 45 minutos, luego homogeneizar el tejido con la brida del émbolo de una jeringa de tres mililitros y transferirlo a tubos cónicos de 15 mililitros. Gire las muestras a 500 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en tres mililitros de RPMI con 10%FCS.
Gire hacia abajo la muestra a 500 veces g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos, luego retire el sobrenadante y resusppend el pellet celular con cinco mililitros de 44%densidad gradiente medio y mezcla RPMI. Coloque la punta de una pipeta de tres mililitros que contenga tres mililitros de 67% de densidad de medio de gradiente y PBS directamente en la parte inferior de cada tubo y libere lentamente la solución para que la solución pesada forme una capa distinta en la parte inferior. Gire las muestras a 900 veces g durante 20 minutos con la reducción de los ajustes del acelerador y el freno, luego retire cuidadosamente los tubos de la centrífuga sin alterar las capas.
Retire la capa superior con una pipeta de transferencia sin tocar la capa de linfocitos y transfiera la capa de linfocitos a un nuevo tubo de 15 mililitros. Llene el tubo con PBS y 5%FCS, luego mezcle invirtiendo lentamente el tubo de cuatro a seis veces. Después de centrifugar las muestras a 500 veces G y cuatro grados Celsius durante cinco minutos, retire el sobrenadante y resuspend el pellet celular con 500 microlitros de medio RPMI completo.
Las células ya están listas para la tinción de citometría de flujo. Incluso después del enriquecimiento de linfocitos mediados por centrifugación por centrifugación por densidad, era muy común ver una gran parte de los linfocitos no linfáticos en el producto final. Sin embargo, después de obtener linfocitos vivos, los linfocitos CD8+T fueron fáciles de identificar.
Como era de esperar, sólo las células CD8+T extra-vasculares adquirieron eficientemente fenotipos de células T de memoria residente en el tejido, como la regulación ascendente de CD69 y la regulación descendente de Ly6C. A diferencia de los ratones infectados, la gran mayoría de las células CD8+T aisladas de ratones jóvenes ingenuos alojados en las instalaciones de SPF fueron etiquetados con anticuerpos alfa CD8 y, por lo tanto, pertenecían al compartimento intravascular. Esta técnica ha acelerado en gran medida la investigación de células inmunitarias residentes en el tejido en órganos densamente vascularizados.
