תאי CD8+T נושאים תכונות שונות ברקמה שונה, כדוגמה קריטית לרקמות לא ריר ולא לימפה. זה חיוני כדי לאפיין ישירות תאים תושבי כליות כדי להבין באופן מלא ביולוגיה של תאי T. כאן נדגים את השיטה הנוחה שלנו לבודד תאי CD8+T תושבי הכליות המתאימים לניתוח ציטומטריית זרימה עוקבת.
שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך המחקרים של תאים CD8 + T אפקטר וזיכרון שנוצר לאחר זיהומים, כמו גם תגובות אוטואימוניות. ההליך יתבצע על ידי ד"ר צ'אויו מא, מדען מחקר במעבדה שלי. התחל בדילול נוגדן אלפא נגד CD8 ביוטין ל-15 מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS, וודא שיש מספיק כדי לנהל 200 מיקרוליטר לכל עכבר.
לפני ההזרקה, מחממים את וריד הזנב של העכבר עם מנורת חום תקורה במשך חמש עד 10 דקות כדי להפוך אותו. ציירו 200 מיקרוליטרים של תערובת הנוגדנים המדוללים מראש למזרק אינסולין של 28 מדים והסירו את כל בועות האוויר על ידי הזזת הבוכנה מעלה ומטה. לכופף את המחט כדי ליצור זווית של 150 מעלות בין המחט לבין המזרק, משופע, כך המחט מקבילה לווריד הזנב.
לרסן את העכבר עם מרסן מכרסמים לרסס את הזנב עם 70% אתנול כדי להפוך את הווריד גלוי בבירור. החזק את הזנב בקצה הדיסטלי עם האגודל והאצבעות האמצעיות של היד הלא דומיננטית, ולאחר מכן מקם את האצבע המורה מתחת לאתר ההזרקה. עם היד הדומיננטית להכניס את המחט לתוך וריד במקביל לכיוון הלב לאט להזריק 200 microliters של הנוגדן.
הסר את המחט בעדינות לדחוס את אתר ההזרקה עד הדימום מפסיק. לאחר המתת חום העכבר, לנתח את הכליה עם מספריים ולהעביר אותו צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. השאירו את הדגימות על הקרח עד לעיבוד נוסף.
הכינו צלחות שש בארות עם שלושה מיליליטר של פתרון עיכול בכל באר, באמצעות באר אחת לכל עכבר, ולאחסן אותם על קרח. הוסף 300 microliters של פתרון העיכול לתוך כל צינור מדגם טחון דגימות הכליה עם מספריים האביב ישר. מעבירים את דגימות הכליות הטחון לצלחות שש בארות עם פתרון העיכול.
הדגירה את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה במשך 45 דקות, ואז הומוגניזציה של הרקמה עם אוגן הבוכנה של מזרק שלושה מיליליטר ולהעביר אותו צינורות חרוט 15 מיליליטר. לסובב את הדגימות למטה ב 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הסר את supernatant ו resuspend גלולה בשלושה מיליליטר של RPMI עם 10%FCS.
לסובב את המדגם ב 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant ולתלות מחדש את גלולת התא עם חמישה מיליליטר של 44% צפיפות הדרגתית בינונית תערובת RPMI. שים את הקצה של פיפטה שלושה מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של 67% שיפוע בינוני PBS ישירות לתחתית של כל צינור לאט לשחרר את הפתרון, כך הפתרון הכבד יוצר שכבה ברורה בתחתית. לסובב את הדגימות ב 900 פעמים g במשך 20 דקות עם הגדרות האצה ובלמים מופחתת, ולאחר מכן להסיר בזהירות את הצינורות מן הצנטריפוגה מבלי להפריע את השכבות.
הסר את השכבה העליונה עם פיפטה העברה מבלי לגעת בשכבת הלימפוציטים ולהעביר את שכבת הלימפוציטים לצינור חדש של 15 מיליליטר. מלאו את הצינור ב-PBS וב-5%FCS, ואז ערבבו על ידי היפוך איטי של הצינור ארבע עד שש פעמים. לאחר צנטריפוגה הדגימות ב 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, להסיר את supernatant ולתלות מחדש את גלולת התא עם 500 microliters של מדיום RPMI מלא.
התאים מוכנים כעת להכתמת ציטומטריית זרימה. גם לאחר העשרת לימפוציטים בתתיווך צנטריפוגה בצפיפות, זה היה נפוץ מאוד לראות חלק גדול של לימפוציטים שאינם במוצר הסופי. עם זאת, לאחר צובר על לימפוציטים חיים, לימפוציטים CD8 +T היו קל לזהות.
כצפוי, רק תאי CD8+T חוץ-וסקולריים רכשו ביעילות זיכרון תושב רקמות T-cell phenotypes, כגון רגולציה של CD69 ורגולציה של Ly6C. בניגוד לעכברים הנגועים, הרוב המכריע של תאי CD8+T המבודדים מעכברים נאיביים צעירים שוכנו במתקן SPF תויגו בנוגדן CD8 אלפא ולכן היו שייכים לתא האינטרווסקולרי. טכניקה זו האיצה מאוד את חקירת תאי החיסון תושבי הרקמות באיברים צפופי כלי דם.
