CD8+T細胞は、非粘膜および非リンパ組織の重要な例として、異なる組織において明確な特徴を運ぶ。T細胞生物学を十分に理解するためには、腎臓に居住する細胞を直接特徴付ける必要があります。ここでは、その後のフローサイトメトリー解析に対応する腎臓に常駐するCD8+T細胞を単離する便利な方法を示します。
この方法は、感染後に生成されたエフェクターおよびメモリCD8+T細胞ならびに自己免疫応答の研究に関する洞察を提供することができる。この手順は、私の研究室の研究科学者であるチャオユ・マ博士によって行われます。まず、PBSでビオチン抗CD8α抗体を1ミリリットル当たり15マイクログラムに希釈し、各マウスに200マイクロリットルを投与するのに十分であることを確認します。
注射する前に、マウスの尾静脈をオーバーヘッドヒートランプで5〜10分間加熱し、拡張します。28ゲージのインスリン注射器に200マイクロリットルの希釈済み抗体ミックスを引き込み、ピストンを上下に動かして気泡を取り除きます。針を曲げて針と注射器の間に150度の角度を作り、針が尾静脈に平行になるようにベベルアップします。
げっ歯類の抑制剤でマウスを拘束し、静脈がはっきりと見えるように70%エタノールで尾をスプレーします。非支配的な手の親指と中指で遠位端の尾を保持し、注射部位の下に人差し指を置きます。支配的な手で心臓の方向に向かって平行に静脈に針を挿入し、ゆっくりと抗体の200マイクロリットルを注入する。
針を外し、出血が止まるまで注射部位を静かに圧縮します。マウスを安楽死させた後、はさみで腎臓を解剖し、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。さらに処理されるまで、サンプルを氷の上に置いておく。
各ウェルに3ミリリットルの消化液を含む6ウェルプレートを準備し、マウスごとに1つの井戸を使用し、氷の上に保存します。各サンプルチューブに300マイクロリットルの消化液を加え、まっすぐなスプリングハサミで腎臓サンプルをミンチします。細かく刻まれた腎臓サンプルを消化液で6ウェルプレートに移します。
37°Cでサンプルを穏やかな揺れで45分間インキュベートし、3ミリリットルのシリンジのプランジャーフランジで組織を均質化し、15ミリリットルの円錐管に移します。サンプルを500倍g、摂氏4度で5分間回転させます。上清を取り除き、10%FCSでRPMIの3ミリリットルでペレットを再懸濁します。
500回gと摂氏4度でサンプルを5分間回転させ、上澄みから取り除き、44%密度の勾配培地とRPMIミックスの5ミリリットルで細胞ペレットを再中断します。67%の密度の勾配媒体とPBSの3ミリリットルを含む3ミリリットルのピペットの先端を各チューブの底に直接入れ、重い溶液が底部に明確な層を形成するように溶液をゆっくりと放出する。サンプルを900回gで20分間回転させ、アクセルとブレーキの設定を減らし、その後慎重に遠心分離機からチューブを取り出します。
リンパ球層に触れることなく、移管ピペットで上層を取り除き、リンパ球層を新しい15ミリリットルチューブに移します。チューブをPBSと5%FCSで満たし、チューブをゆっくりと反転して4〜6回混ぜます。5分間G500倍と摂氏4度でサンプルを遠心した後、上清を取り除き、完全なRPMI培地の500マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁します。
細胞はフローサイトメトリー染色の準備が整いました。密度遠心分離媒介リンパ球濃縮後も、最終製品では非リンパ球の大部分を見るのが非常に一般的であった。しかし、生きたリンパ球を得た後、CD8+Tリンパ球は同定しやすい。
予想通り、超血管CD8+T細胞のみが効率的に組織常駐記憶T細胞表現型、CD69のアップレギュレーションおよびLy6Cのダウンレギュレーションなどの組織常駐記憶表現型を獲得した。感染したマウスとは対照的に、SPF施設に収容された若いナイーブマウスから分離されたCD8+T細胞の大半はCD8アルファ抗体で標識され、したがって血管内コンパートメントに属していた。この技術は、血管の密度の高い臓器における組織常駐免疫細胞の研究を大幅に加速している。
