CD8+T 세포는 비점막 및 비 림프구 조직의 중요한 예로 다른 조직에서 뚜렷한 특징을 지니고 있습니다. 신장에 거주하는 세포를 직접 특성화하여 T 세포 생물학을 완전히 이해하는 것이 필수적입니다. 여기에서 우리는 신장 거주자 CD8+T 세포를 연속적인 유동 세포 분석 수용하는 우리의 편리한 방법을 보여줄 것입니다.
이 방법은 감염 후 생성 된 이펙터 및 메모리 CD8+T 세포의 연구와 자가 면역 반응에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 절차는 닥터 Chaoyu Ma, 나의 실험실을 위한 연구 과학자에 의해 수행됩니다. PBS에서 밀리리터당 15 마이크로그램으로 비오틴 항체 를 희석하여 각 마우스에 200 마이크로리터를 투여하기에 충분하다는 것을 확인하십시오.
주입 하기 전에, 그것을 팽창 하는 5 ~ 10 분 동안 오버 헤드 열 램프와 마우스의 꼬리 정맥을 가열. 28 게이지 인슐린 주사기에 미리 희석 된 항체 믹스의 200 마이크로 리터를 끌어 와서 피스톤을 위아래로 이동하여 기포를 제거합니다. 바늘을 구부려 바늘과 주사기 사이의 150도 각도를 만들고, 바늘이 꼬리 정맥과 평행하도록 구부립니다.
설치류 제지로 마우스를 억제하고 70%에탄올로 꼬리를 살포하여 정맥을 선명하게 보이게 합니다. 비 지배적 인 손의 엄지 와 가운데 손가락으로 말단 끝에 꼬리를 잡고, 주사 사이트 아래에 검지 손가락을 배치합니다. 지배적 인 손으로 바늘을 심장의 방향을 향해 병렬로 정맥에 삽입하고 항체의 200 마이크로 리터를 천천히 주입하십시오.
바늘을 제거하고 출혈이 멈출 때까지 주입 부위를 부드럽게 압축합니다. 마우스를 안락사한 후, 가위로 신장을 해부하고 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기다. 추가 처리될 때까지 샘플을 얼음 위에 둡니다.
각 우물에 3밀리리터의 소화용액으로 6웰 플레이트를 준비하고 마우스당 1개의 잘 사용하여 얼음에 보관합니다. 각 샘플 튜브에 300 마이크로리터의 소화용액을 추가하고 신장 샘플을 직선 스프링 가위로 다진다. 다진 신장 샘플을 소화 용액을 사용하여 6웰 플레이트로 옮길 수 있습니다.
샘플을 섭씨 37도에서 45분 동안 부드러운 흔들림으로 배양한 다음, 3밀리리터 주사기의 플런저 플랜지로 조직을 균질화하고 15밀리리터 원옥 튜브로 옮기습니다. 샘플을 500배, 섭씨 4도에서 5분간 회전합니다. 상체를 제거하고 10 %의 FCS로 RPMI의 세 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
5분 동안 500배, 섭씨 4도에서 시료를 스핀다운한 다음, 상체를 제거하고 44%밀도 그라데이션 배지 및 RPMI 믹스의 5밀리리터로 셀 펠릿을 재놓습니다. 각 튜브의 바닥에 67%밀도 그라데이션 배지 및 PBS의 3밀리리터를 포함하는 3밀리리터 파이펫의 끝을 넣고 무거운 용액이 바닥에 뚜렷한 층을 형성하도록 천천히 용액을 방출한다. 가속기와 브레이크 설정이 줄어 20분 동안 900배 g로 샘플을 돌린 다음 레이어를 방해하지 않고 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거합니다.
림프구 층을 만지지 않고 이송 파이펫으로 상단 층을 제거하고 림프구 층을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮습니다. 튜브를 PBS 및 5%FCS로 채운 다음 튜브를 4~6회 천천히 반전시켜 섞습니다. 5분 동안 500배 G와 섭씨 4도에서 샘플을 원심분리한 후, 상퍼를 제거하고 500마이크로리터의 완전한 RPMI 배지로 세포 펠릿을 재연한다.
세포는 이제 유동 세포피성 염색을 위한 준비가 되었습니다. 밀도 원심분리-매개 림프구 농축 후에도 최종 제품에서 비 림프구의 상당 부분을 보는 것이 매우 일반적이었습니다. 그러나, 살아있는 림프구에 얻은 후, CD8+T 림프구는 쉽게 식별 하기 쉬웠다.
예상대로, 외반 CD8+T 세포만이 CD69의 강화 조절 및 Ly6C의 하향 조절과 같은 조직 상주 메모리 T 세포 표현형을 효율적으로 획득하였다. 감염된 마우스와는 달리, SPF 시설에 수용된 젊은 순진한 마우스로부터 분리된 CD8+T 세포의 대다수는 CD8 알파 항체로 표지되어 따라서 내트라바스칸 구획에 속했다. 이 기술은 조밀하게 혈관화한 기관에 있는 조직 거주자 면역 세포의 조사를 크게 가속화했습니다.
