Edhazardia aedis es un parásito microsporidiano que infecta específicamente a los mosquitos Aedes aegypti. Criar este parásito puede ser un desafío para los nuevos investigadores debido a la complejidad del ciclo de vida del parásito. Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para la cría de E.aedis, incluyendo cómo cronomar correctamente los pasos para el procedimiento, identificar esporas infecciosas y propagar la próxima generación de parásitos.
La sincronización precisa de este protocolo puede ser difícil y puede requerir algún ensayo y error. Identificar las esporas también puede ser difícil. Las ayudas visuales de este protocolo deben proporcionar asistencia.
Para empezar, incuba huevos A.Aegypti infectados con E.aedis colocándolos en una bandeja de cría larvaria con un litro de agua desionizada y añadiendo 50 miligramos de alimento para peces. Alberga a los mosquitos a 27 grados centígrados y al 80% de humedad relativa con un ciclo de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad. Después de la eclosión, reduzca la densidad de larvas a aproximadamente 100 larvas por bandeja, haciendo nuevas bandejas según sea necesario.
Agregue un trozo de comida seca para gatos a cada bandeja. Reponer los alimentos cuando se agoten, pero no proporcionen ningún exceso de comida. Un pedazo de 200 miligramos de comida para gatos cada tres días es suficiente.
Cuando las larvas infectadas son de la tercera a la cuarta estrella, incuban huevos A.aegypti no infectados en una nueva bandeja. Trasero de los mosquitos en densidades de tal manera que A.aegypti saludable alcance la segunda a tercera estrella en 48 a 72 horas. La eclosión de lotes de huevos sanos durante varios días puede garantizar que las larvas estén en la etapa correcta cuando sea necesario.
Para cosechar y cuantificar las esporas uninuleas, utilice una pipeta de transferencia para mover 10 larvas de cuarta estrella infectadas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Retire el agua de reproducción con una pipeta de transferencia y lave las larvas una vez añadiendo aproximadamente un mililitro de agua desionizada limpia. Retire el agua de lavado y agregue 500 microlitros de agua desionizada limpia a las 10 larvas y homogeneizarlas con un pestillo y un homogeneizador mecánico.
Cargue 10 microlitros de homogeneizar en un hemocitoómetro y cuantifique las esporas a un aumento de 400X. Haga una mezcla de alimentos larvarios frescos mezclando 1,2 gramos de polvo de hígado, 0,8 gramos de levadura de cerveza y 100 mililitros de agua. Transfiera larvas de A.a.aegypti sanas de 100 segundos a la tercera estrella en vasos de 150 mililitros o vasos de muestras y agregue cinco veces 10 a la cuarta a una por 10 a la quinta espora a cada taza con una pipeta.
Añadir dos mililitros de purines de comida larval y agua desionizada para un volumen final de 100 mililitros. Después de 12 a 24 horas de exposición, transfiera las larvas a bandejas de cría. Agregue los alimentos y redotallos a la edad adulta.
Controlar las larvas dosificadas para la pupación y transferir pupas a una taza de emergencia en una jaula. Azúcar alimenta a los adultos ad libitum. La sangre alimenta a los adultos de acuerdo con los protocolos estándar disponibles a través de BEI Resources.
Recoger los huevos de los adultos alimentados con sangre. La transmisión vertical de E.aedis se produce en este paso. Cuando haya terminado, limpie todos los materiales que entraron en contacto con E.aedis con 10% de lejía y autoclaves para evitar la contaminación.
Este protocolo demuestra el procedimiento completo necesario para propagar E.aedis en mosquitos A.aegypti. Los huevos de A.aegypti infectados con E.aedis fueron incubados y las larvas fueron criadas a la cuarta etapa instar. En la cuarta etapa instar, se pudieron observar signos visuales de infección como esporocitos blancos en todo el cuerpo graso de las larvas infectadas.
Las esporas no inucleadas se cosecharon de las cuartas larvas instar mediante la homogeneización de 10 larvas en 500 microlitros de agua desionizada. Estas esporas eran piriformes y fácilmente visibles con aumento de 400X. Se calculó un recuento de esporas de 4.050 esporas por microlitro y estas esporas se utilizaron para infectar larvas sanas a través de la transmisión horizontal.
El estado de infección y las cargas de E.aedis de 25 larvas de generación filial se evaluaron a los siete días después de la eclosión. La tasa de infección vertical de E.aedis en la generación filial fue del 96% y la carga media de esporas de individuos infectados a los siete días después de la captura fue de 3,31 veces 10 a la quinta. Para coordinar adecuadamente la puesta en escena larvaria, es aconsejable tener en cuenta cierta variabilidad en el tiempo de cría.
Además, el número de esporas aumenta rápidamente, por lo que si no detectas esporas, solo vuelve a intentarlo al día siguiente. Buena suerte.
