El valor único de este protocolo es que dos miembros del personal que utilizan equipos fácilmente disponibles en pequeños espacios de laboratorio pueden producir suficientes mosquitos estériles para apoyar un programa SIT operativo de 50 acres. La eficiencia y el bajo costo de esta técnica la hacen accesible, intratable incluso para los pequeños distritos de control de mosquitos para aumentar su programa integrado de control de vectores. Demostraremos el procedimiento y yo y Barbara Bayer, técnicos de laboratorio de ciencias biológicas de la unidad de investigación.
Para criar Aedes aegypti adulto de las pupas, prepare jaulas de crianza de aluminio plegables de 60 por 60 por 60 centímetros con malla de fibra de vidrio de 0.84 por 0.84 milímetros y una manga de calcetín en una pared vertical de cada jaula. Coloque un vaso de plástico de 1.900 mililitros con pupas de Aedes aegypti en una proporción de sexos de uno a uno en cada jaula de cría y cierre la manga, dejando las copas en jaulas para la eclosión durante unos cuatro días a 28 a 30 grados centígrados superiores al 50% de humedad relativa en un ciclo de luz:oscuridad a las 12:12 o 14:10 hasta que no surjan más adultos. 24 horas después de colocar las pupas en las jaulas de cría, coloque un recipiente de solución de sacarosa al 10% con una mecha de esponja en cada jaula y suspenda una esponja de 10 por 2 centímetros empapada en miel de un gancho de alambre para proporcionar hidratación y nutrición respectivamente a los mosquitos adultos.
48 a 72 horas después de que la mayoría de los adultos hayan salido cada dos o tres días durante las próximas tres o cuatro semanas a partir de entonces, llene el condón de piel de cordero con 50 a 100 mililitros de sangre bovina desfibrinada por jaula, y caliente los condones a aproximadamente 37 grados centígrados en un baño de agua caliente. Después de palmear cuidadosamente los condones con la toalla, coloque los condones parcialmente secos en placas de Petri forradas de papel individuales dentro de las jaulas durante 30 a 60 minutos. De 48 a 72 horas después de cada alimentación de sangre, coloque una taza de oviposición de 1, 900 mililitros que contenga 800 mililitros de agua de pupa filtrada y provista de una hoja de 8 a 10 por 30 centímetros de papel de germinación de semillas colocada a ras a lo largo de la circunferencia interna de la taza en cada jaula.
Para criar las larvas de Aedes aegypti de los huevos, use un papel de oviposición con 5, 000 a 10, 000 huevos presentes y corte una sección de tres a siete centímetros perpendicular a la línea de oviposición. Coloque la pieza en un nuevo recipiente de 460 mililitros medio lleno de agua del grifo y una pizca de copos de comida para peces pulverizados. Cubra y agite el recipiente vigorosamente durante al menos un minuto antes de verter todo el contenido en una sartén para criar larvas que contenga tres litros de agua del grifo y 50 mililitros de lechada marrón.
Marque la sartén con la fecha de inicio, la información de la cepa y el horario de alimentación. Una vez que se haya alcanzado la proporción umbral aproximada de larvas en las sartenes para larvas, vierta el contenido de cada sartén a través de un tamiz de tamaño 20 a 40 y use una botella exprimida de agua del grifo para lavar las pupas y las larvas del tamiz en un vaso de precipitados de plástico graduado de tres litros. Para separar las pupas macho de las larvas y las pupas hembra, divida el contenido de cada vaso de precipitados entre múltiples recipientes de plástico de 1.9 litros y coloque un recipiente de recolección rígido y poco profundo de cuatro litros debajo de la esclusa en la base de un separador de pupa.
Llene dos vasos de plástico graduado de tres litros aproximadamente tres cuartos llenos de agua del grifo y vierta el agua a través del espacio entre las placas de vidrio del separador mientras ajusta las perillas superior e inferior para permitir que el agua fluya continuamente a través del separador. Una vez que el agua estancada se haya acumulado uniformemente a una altura de aproximadamente 1,25 centímetros desde la base de las placas, marque las posiciones iniciales en las perillas inferiores del separador con cinta adhesiva y comience a verter los recipientes de pupas y larvas en el separador mientras gira continuamente las perillas inferiores en sentido contrario a las agujas del reloj de uno a dos centímetros de las posiciones iniciales. Cuando la mayoría o todas las larvas se hayan lavado a través de la esclusa en el recipiente de recolección, detenga el flujo de agua y use un tamiz número 30 para limpiar el recipiente de recolección de las larvas.
Cuando se hayan eliminado todas las larvas, vierta el agua y ajuste las perillas nuevamente para permitir que las pupas macho se enjuaguen en el recipiente de recolección. Luego vierta las pupas macho del recipiente en un tamiz número 20 y use una botella de un litro de agua del grifo para lavar las pupas del tamiz en un recipiente separado de 1.9 litros. Cuando se hayan recogido todas las pupas macho, vierta el agua y ajuste las perillas para permitir que se recojan las pupas hembras.
Usando el tamiz número 20 para transferir las pupas hembras a un nuevo recipiente de 1,9 litros como se acaba de demostrar. Luego vierta el agua y ajuste las perillas nuevamente hasta que todos los mosquitos inmaduros hayan sido expulsados del separador. Cuele las pupas macho recolectadas con un colador y lave la caca en un vaso de precipitados graduado de un litro con la menor cantidad de agua posible.
Vierta cuidadosamente las pupas en placas de Petri forradas con papel de filtro húmedo en una sola capa. Retire el agua estancada del fondo de la placa de Petri con una pipeta fresca de pasto de tres mililitros para evitar el movimiento de la pupa durante el trabajo. Agrupe las placas de Petri y las pilas antes de sellarlas dentro de una bolsa resellable de 3,8 litros etiquetada para que quepa en la cámara de irradiación.
Para marcar lotes cuantificados de mosquitos machos adultos irradiados, retire cualquier fuente de nutrición de la jaula de cría y coloque una jaula en una cámara grande de dióxido de carbono durante cinco a siete minutos, golpeando los lados del recipiente para desalojar cualquier mosquito que se adhiera a las paredes. Al final del período de exposición, transfiera los mosquitos a un vial aspirador y anestesie a los mosquitos nuevamente antes de agitar los mosquitos en una superficie de trabajo cubierta de papel blanco. Aspirar cuidadosamente todos los machos de la superficie de trabajo en un nuevo vial y repetir las exposiciones y la recolección hasta que todos los machos adultos hayan sido recogidos de todas las jaulas de cría.
En algún momento durante el proceso de clasificación por sexo, genere un vial que contenga solo 25 mosquitos machos adultos. Cuando todos los machos hayan sido recolectados, pese cada vil de mosquitos en un bote de pesaje con tara en una balanza, y vierta rápidamente los mosquitos pesados en un recipiente de cartulina de 240 mililitros que contenga 50 miligramos por tinte marcador. Incline y gire el recipiente una rotación completa en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj hasta que todos los mosquitos hayan sido ligeramente cubiertos y vierta los mosquitos en un nuevo bote de pesaje, luego doble el bote de pesaje por la mitad para permitir que los mosquitos se canalicen a través de la manga de la estona hacia el recipiente de liberación.
Cuando se hayan agregado aproximadamente dos gramos de mosquitos machos al contenedor de liberación, ate la manga de la estona cerrada y marque la cinta de etiquetado en el bisel del recipiente de liberación con el color del tinte, el número del recipiente y el peso total de los mosquitos. En este experimento representativo de cría, irradiación y comercialización de mosquitos adultos Aedes aegypti, se pudieron recolectar dos gramos de mosquitos adultos machos de tres jaulas de cría y junto con dos viales de 25 machos de dos jaulas para permitir el cálculo del peso promedio por mosquito. 25 hembras fueron descartadas en total de dos de los lotes.
La alimentación oportuna y observacional durante la semana de crianza de las larvas es fundamental para generar pupas bien desarrolladas para la separación. Esto genera una clara distinción entre machos y hembras que conduce a una baja incidencia de hembras en los pasos de marcado. Además de usarlos en programas operativos de TIE, estos machos estériles también se pueden usar ampliamente en experimentos que investigan la competencia de apareamiento, la supervivencia y la dispersión de machos irradiados en comparación con los machos salvajes no irradiados.
La modificación de la técnica para incluir mosquitos hembra nos permite investigar el impacto de la liberación no intencional de hembras irradiadas con respecto a la fecundidad y la competencia vectorial.
