Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Academia de Finlandia [315948, 314387 a N.K.]; Fundación Sigrid Jusélius [a N.K., J.T.]; Fundación Emil Aaltonen [a J.-A.M., T.L.]; Programa de Doctorado en Medicina Molecular de Turku [S.C.-M., O.O.].

El mantenimiento de ratones de laboratorio y todos los experimentos con animales se realizó de conformidad con las directrices y regulaciones pertinentes para el cuidado y uso de animales de laboratorio en la Universidad de Turku.
1. Preparación de tubulos semeferosos para microdissección
<ol><li>Sacrificar un ratón macho adulto (≥8 semanas de edad, testis 80–120 mg dependiendo de la cepa y la edad) a través de la asfixia de CO2 seguido de dislocación cervical. NOTA: El ratón debe ser sexualmente maduro, y preferiblemente por lo menos 8 semanas de edad. El patrón de transilluminación de ratones juveniles difiere de los adultos porque la onda del epitelio seminiferoso aún no se ha establecido completamente, y el tiempo de la primera onda de espermatogénesis es distinto21,22. La falta de espermatozoides alargados en ratones machos de 4 semanas de edad impide su uso para la microdisección asistida por transilluminación. Todas las cepas de ratón que tienen espermatogénesis normal se pueden utilizar.</li>
	<li>Rocíe el abdomen ventral con un 70% de etanol. Abra la cavidad abdominopelvica con tijeras estériles, haciendo una abertura en forma de V.</li>
	<li>Tirando de la almohadilla de grasa epidídmica con fórceps estériles, localice los testículos, diseccionarlos con tijeras y colóquelos en una placa estéril de Petri de 100 mm que contenga PBS. NOTA: Para mantener la esterilidad, asegúrese de que todos los artículos de laboratorio y herramientas quirúrgicas sean estériles.</li>
	<li>El uso de tijeras de punta fina decapsula los testículos cortando una hendidura en la tunica albuginea,la gruesa lámina fibrosa que encapsula los testículos. A continuación, desgarre la tunica con un par de fórceps. Fuerza los túbulos presionando con fórceps y desecha el tunica. NOTA: Al descartar la tunica, podría ser beneficioso para algunas aplicaciones aguas abajo que arteria testicularis se elimina junto con la tunica. Evite dañar los túbulos seminiferosos.</li>
	<li>Mueva los tubulos semestrales a una nueva placa De Petri y vierta suficiente PBS estéril para cubrir la parte inferior de la placa De Petri. A continuación, desgarra suavemente los túbulos, pero evita dañar los túbulos. NOTA: Demasiado estrés mecánico afectará al patrón de transilluminación y afectará la viabilidad del tejido y su arquitectura celular. Los túbulos también se pueden procesar para inmunostainings de montaje completo desde este punto sin ensayo (3B). A veces basta con definir la etapa retrospectivamente mediante la inclusión de anticuerpos contra proteínas expresadas en espermatogonia diferenciadora, como SALL4, c-KIT y DNMT3A18,23. La densidad de espermatogonia es un indicador de etapa relativamente fiable (Figura 2).</li>
</ol>2. Microdissección asistida por transilluminación
<ol><li>Coloque la placa Petri bajo un microscopio de disección firmemente grabándola en el escenario. NOTA: Es importante grabar bien la placa Petri para evitar su movimiento, lo que podría causar la mezcla de los segmentos de tubérculos semeferosos escenificados recogidos.</li>
	<li>Para revelar el patrón de absorción de luz de los túbulos semeferosos bajo enfoque, asegúrese de que la muestra se ilumina desde abajo y la luz pasa a través de la muestra, es decir,se transillumina. NOTA: La cantidad de luz absorbida/dispersa es relativa al nivel de condensación de cromatina en espernátidos alargados y su agrupación dentro del tubérculo seminferoso: cuanto más condensado, más luz se absorbe, es decir,aparece más oscuro.</li>
	<li>Familiarícese con el patrón de absorción de luz de diferentes etapas como se describe en la Figura 2, Figura 5A y Figura S1 moviendo cuidadosamente haces de túbulos usando fórceps finos. NOTA: Las etapas siempre se siguen entre sí en un orden lógico, formando la onda de epitelio seminiferoso. Sin embargo, es importante saber que la dirección de la onda espermatogénica ocasionalmente se invierte y luego retrocede de nuevo (también conocidas como modulaciones4,9),a veces complicando el procedimiento. Además, la longitud de cada etapa, en términos de cuántos mm de tubérculo, varía considerablemente.</li>
	<li>Levante cuidadosamente el tubérculo de interés usando fórceps con una punta enganchada, y luego corte un segmento de longitud apropiada usando tijeras de microdissección (ver Video Suplementario 1). Un gancho en la punta de los fórceps hace que levantar y sostener un tubérculo sea más fácil y ayuda a evitar apretarlo. NOTA: La longitud de los segmentos a cortar depende de las aplicaciones posteriores. Para la recolección de piezas de tubérculos agrupados de una etapa específica para el análisis de proteínas o ARN12,13 (II-V, VII–VIII y IX-XI, Figura 5B)la longitud es típicamente de 2-5 mm. Cuando se utiliza extracción estándar de fenol-cloroformo, alrededor de 200 ng de ARN se pueden derivar de 1 mm de tubérculo. Para la tinción de montaje completo de segmentos de tubérculos escenificados, la longitud de los segmentos debe ser de >5 mm. Para las preparaciones de calabaza, la longitud de los segmentos no debe exceder de 1-2 mm porque las células en el centro del segmento pueden no salir si es demasiado larga. Utilice una escala mm debajo de la placa Petri para una medición precisa de la longitud del tubérculo.</li>
</ol>3. Inmunodetención de diferentes preparaciones
<ol><li>Preparación de calabazas: verificación de etapas e inmunodetención NOTA: Las piezas de tubérculos específicas del escenario se pueden aplastar en un tobogán de microscopio con un vidrio de cubierta para realizar análisis morfológicos de las células vivas mediante microscopía de contraste de fase e inmunostaining posterior. Se recomienda a un principiante utilizar este enfoque para verificar las etapas al familiarizarse con el método de microdissección asistido por transilluminación.<ol>
<li>Recoge el segmento en un volumen de 10 μL usando una pipeta y muévelo a una diapositiva de microscopio.</li>
		<li>Aplaste el tubérculo colocando un vaso de cubierta (20 mm x 20 mm) cuidadosamente en el tubérculo. Como resultado, las células fluirán fuera del tubérculo y formarán una monocapa de células vivas. Coloque un papel filtrante en el borde del vidrio de la cubierta para facilitar la propagación de las células. Evite aplastar las células demasiado para mantenerlas vivas.</li>
		<li>Monitoree la propagación celular bajo un microscopio. Utilice un microscopio de contraste de fase en el objetivo 40x para verificar el reconocimiento de etapas examinando los tipos de células presentes (Figura 2, Figura S2).</li>
		<li>Una vez que las células se hayan extendido para formar una monocapa redonda desde ambos extremos del tubérculo, sumerja la diapositiva en un recipiente que contenga nitrógeno líquido mientras la sujeta con fórceps. Mantenlo sumergido durante 10 s. Alternativamente coloque el tobogán en una placa de hielo seco para congelarse.</li>
		<li>Retire el vaso de la cubierta volteándolo con un bisturí.</li>
		<li>Sin demora, proceda con la fijación y coloque rápidamente la diapositiva en un recipiente con un 90% de etanol durante 2-5 min. NOTA: Asegúrese de que la preparación de la calabaza no se descongele antes de colocarla al 90% de etanol. También se pueden utilizar otros fijadores, como la acetona, durante 10 minutos.</li>
		<li>Aire seco y almacenar a temperatura ambiente (RT) (hasta algunos días) o a -80 °C (largo plazo).</li>
		<li>Para la inmunodetención, después de fijar las muestras en 4% paraformaldehído (PFA) durante 10 min en RT.</li>
		<li>Enjuague en PBS y permeabilice con 0.1% Tritón X-100 en PBS durante 5 min.</li>
		<li>Enjuague en PBS y dibuje un anillo de grasa alrededor de cada muestra de calabaza.</li>
		<li>Añadir 50–100 μL de 10% BSA (albúmina sérica bovina) en 0.1% De interpolación en PBS (PBST) dentro del anillo de grasa y bloquear muestras durante 30 minutos en RT.</li>
		<li>Retire la solución BSA e incuba con un anticuerpo primario diluido en 10% BSA en PBST durante 1 h en RT.</li>
		<li>Lave 3x durante 5 minutos con PBST.</li>
		<li>Incubar con un anticuerpo secundario diluido en 10% BSA en PBST. NOTA: Para manchar los acromas, las muestras se pueden incubar con anticuerpos de aglutinina de cacahuete etiquetados con rhodamina (PNA, 1:1000) en 10% BSA en PBST durante 1 h en RT (Figura S3) en lugar de anticuerpos primarios y secundarios específicos.</li>
		<li>Lave 3x durante 5 minutos cada uno con PBST, enjuague con PBS y monte con un soporte que contenga DAPI.</li>
	</ol></li>
	<li>Inmunostaining integral de tubulos seminferosos NOTA: El protocolo siguiente describe la tinción de montaje completo para segmentos de tubérculos por etapas (desde el paso 2.4). Si un investigador quiere realizar manchas de montaje completo sin ensayo (desde el paso 1.5), preste atención a las notas en 3.2.1 y 3.2.7.<ol>
<li>Usando una pipeta, transfiera los segmentos de tubérculos (desde el paso 2.4) en PBS helado a un tubo cónico de 15 ml y déjalos sedimentar sobre hielo. NOTA: Si usa tubulos sin etiquetar de 1.5., separe los túbulos en una placa de Petri pipeteando hacia arriba y hacia atrás en un plato inclinado varias veces. Use una pipeta de 1 ml con una punta de corte. Este paso está destinado a abrir la estructura del tejido. Sin embargo, evite demasiado pipeteo, ya que podría dañar los túbulos. La sedimentación de los tubulos tomará unas decenas de segundos. Pequeños fragmentos de tubérculos, células intersticiales y desechos celulares permanecen en el sobrenadante.</li>
		<li>Retire cuidadosamente el sobrenadante (SN) pipeteando o con un aspirador. Agregue 10 ml de PBS helado y mezcle por inversión.</li>
		<li>Deje sedimentar y luego eliminar SN como antes.</li>
		<li>Añadir 5 mL de 4% PFA y fijar para 5 h en una mesa giratoria (20–30 rpm) a +4 °C. NOTA: El tiempo de fijación depende de las proteínas de interés y su localización subcelular. Para las proteínas nucleares y citoplasmáticas, una fijación de 2 h es típicamente suficiente, sin embargo, marcadores de membrana, como GFRα1 (receptor de la familia GDNF alfa 1; Figura 6A,B), beneficiarse de una fijación más larga, hasta 6 h.</li>
		<li>Permitir sedimentar, eliminar SN (PFA) como antes, y enjuagar brevemente añadiendo 10 mL de PBS e invirtiendo el tubo.</li>
		<li>Dejar sedimentar, eliminar SN como antes y repetir el paso de lavado PBS tres veces durante al menos 10 minutos cada uno en una mesa giratoria a +4 °C y proceder con la tinción o almacenar a +4 °C. NOTA: Si las condiciones de trabajo son estériles y limpias, las muestras se pueden almacenar y utilizar durante al menos algunas semanas. Alternativamente, añadir Azide de sodio a una concentración final de 0.02% (w/v) de una solución de stock del 2% para ayudar a preservar los túbulos antes de almacenar a +4 °C.</li>
		<li>Con una pipeta de 1 ml, mueva segmentos de tubérculos fijos de 10 a 20 a un tubo de fondo redondo de 2 ml. Permitir sedimentar y eliminar SN. NOTA: Si trabaja con tubulos largos que no han sido escenificados, vierta los túbulos sobre una placa Petri y usando tijeras de microdisección y fórceps corte segmentos de alrededor de 5-20 mm. Segmentos demasiado largos se enredarán durante el procedimiento de tinción, mientras que los segmentos demasiado cortos se pierden fácilmente.</li>
		<li>Añadir 1 ml de 2% BSA + 10% FBS (suero bovino fetal) en 0.3% Tritón X-100 en PBS (PBSX). Bloquee durante al menos 1 h en una mesa giratoria (20-30 rpm) en RT.</li>
		<li>Enjuague con 1 ml de PBSX, retire la SN pipeteando y agregue 250 μL de anticuerpo primario diluido en 1% BSA en PBSX (dilución 1:100–1:2000). Incubar durante 2 h a RT o durante la noche a +4 °C en una mesa giratoria (20-30 rpm).</li>
		<li>Retire la solución de anticuerpos pipeteando y enjuague los túbulos con 1 ml de PBSX como arriba. Lave tres veces durante 1 h en PBSX en una mesa giratoria (20-30 rpm) en RT. NOTA: Después de este primer lavado, la muestra se puede dejar durante la noche a +4 °C si es necesario.</li>
		<li>Retire la SN y agregue 250 μL de anticuerpo secundario diluido en 1% BSA en PBSX (típicamente dilución de 1:500 de un anticuerpo con etiqueta fluorescente). Cubra en papel de aluminio e incubar en una mesa giratoria (20-30 rpm) en RT durante 1 h.</li>
		<li>Repita 3.2.10.</li>
		<li>Finalmente retire SN y vierta los túbulos a una diapositiva de microscopio. Separe suavemente y organice los tubulos en tiras lineales con puntas de carga de gel. Escurrir el exceso de búfer y añadir medio de montaje y un tubo de cubierta. NOTA: Evite secar los túbulos mientras los organiza. La contra-tinción de los núcleos con DAPI no es necesaria en la mayoría de los casos. Cierre el borde de la cubierta con esmalte de uñas para evitar el secado y el deterioro de la muestra. Las diapositivas se pueden almacenar durante 1-2 semanas a +4 °C antes de la toma de imágenes.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology:+Seminiferous+Cycle.">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Oakberg, E. 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Los autores no tienen nada que revelar.

El método de microdissección asistido por transilluminación que hemos descrito anteriormente permite un enfoque orientado a la etapa para el estudio de la espermatogénesis. La espermatogénesis es un proceso altamente sincronizado, y todos los pasos clave durante la diferenciación espermatogénica se regulan y ejecutan de manera dependiente de la etapa, como el compromiso de diferenciación (en las etapas VII-VIII), el inicio de la meiosis (VII-VIII), las divisiones meioticas (XII), el inicio de la elongación espermática (VIII) y la espermatación (VIII)1,26,27. El análisis orientado a la etapa proporciona una poderosa herramienta para estudiar estos eventos particulares que están restringidos a pasos específicos de la espermatogénesis y por lo tanto se encuentran sólo en etapas definidas del ciclo epitelial seminiferoso. Dominar el método requiere cierta práctica y el uso de un microscopio de disección de buena calidad y condiciones de iluminación adecuadas son clave para el éxito. La implementación de este método como parte del kit de herramientas cotidiano tiene una capacidad para mejorar en gran medida el impacto y la relevancia biológica de la investigación en las funciones reproductivas masculinas al permitir una disección más precisa de los eventos moleculares durante la espermatogénesis.
Todas las cepas de ratón WT que hemos estudiado muestran un patrón de transilluminación similar y exhiben asociaciones celulares conservadas en etapas del ciclo epitelial seminiferoso. Con la condición de que la diferenciación espermatogénica de las células germinales no sea groseramente diferente de los ratones WT, lo mismo se aplica a todos los modelos de ratón knock-out que hemos estudiado. Además, se puede aplicar a otras especies que exhiben disposición segmental longitudinal de etapas del ciclo epitelial seminferoso7. Sin embargo, no se pueden utilizar especies con etapas no segmentadas (como las humanas). Dado el papel esencial de la condensación de cromatina en espermatozoides alargadores en la definición del patrón de transilluminación, está claro que cualquier desregulación de este proceso inevitablemente obstaculizará la implementación de este método. En ratones juveniles y adultos jóvenes (5-6 semanas) el patrón de transilluminación aún no se ha establecido completamente y, por lo tanto, sólo se deben utilizar ratones mayores de 8 semanas. También es importante tener en cuenta que apretar y tirar de los túbulos inevitablemente obstaculizará el patrón de transilluminación porque distorsiona la arquitectura celular dentro del epitelio seminiferoso.
Los segmentos aislados de tubérculos seminiferosos también se pueden cultivar permitiendo la observación ex vivo y la manipulación de procesos acoplados a la espermatogénesis, incluida la meiosis. Para garantizar la viabilidad del tejido y evitar la degradación del ARN y las proteínas, las muestras deben recogerse y procesarse no más de 2 horas después de sacrificar el ratón. Para la cultura ex vivo de los tubulos semeferosos, el tiempo del sacrificio al inicio de la cultura no debe exceder de 1 hora. La integridad de los fragmentos de tubérculos normalmente se puede mantener hasta 72 horas in vitro si se cosecha correctamente.
La etapa del ciclo epitelial seminferoso se puede verificar y definir con mayor precisión mediante microcopía de contraste de fase de preparaciones de calabaza16. La microscopía se realiza en células vivas, lo que proporciona una dimensión adicional en el análisis y permite la observación de movimientos organelle o celulares en etapas específicas de la espermatogénesis28,29,30. La microscopía de contraste de fase proporciona una puesta en escena exacta para el inmunostaining posterior, lo que permite un análisis muy detallado de la expresión proteica y la dinámica de localización durante la espermatogénesis, incluidos los cambios específicos de la etapa.
Mientras que las células se liberan del contexto epitelial en preparaciones de calabaza, los inmunostainings de montaje completo de segmentos de tubérculos permiten el estudio de células espermatogénicas en su entorno fisiológico. Por lo tanto, las preparaciones de montaje completo pueden proporcionar una mejor visualización de la arquitectura seminiferosa de tubérculos y sus contactos intercelulares que la inmunodetención en secciones transversales. Es importante destacar que la puesta en escena asistida por transilluminación de los segmentos de tubérculos antes de la inmunodetención hace que el enfoque sea aún más potente al incluir información sobre la etapa específica de un segmento determinado. La tinción integral es una herramienta particularmente útil para el estudio de células en la periferia de los túbulos semeferosos, como las células mioides peritubulares, macrófagos peritubulares y espermatogonia, pero también podría abrir nuevos conocimientos sobre la investigación sobre células germinales meioticas y postmetóticas.

La diferenciación de las células germinales masculinas de la espermatogonia diploide a los espermatozoides haploides maduros, es decir,la espermatogénesis, es un proceso complejo que tiene lugar en el epitelio de los túbulos semeferosos en los testículos de un individuo sexualmente maduro1. Los descendientes mitoticos de la espermatogonia A1 primero se dividen cinco veces para expandir la población comprometida con la diferenciación, luego entran en la meiosis como espermatozoides que finalmente dan lugar a espermatozoides haploides. La diferenciación de espermatozoides redondos en espermatozoides, es decir,espermatogénesis, implica cambios complejos en la morfología celular, incluyendo la compactación nuclear y la construcción de estructuras específicas de espermatozoides como el acrosoma y el flagelo. En ratone, todo el proceso de espermatogénesis tarda 35 días encompletarse 2,3.
En cualquier lugar dado, el epitelio seminferoso alberga hasta cinco cohortes de células germinales diferenciadoras, además de las células madre/progenitoras germinales y las células sertoli somáticas1. Las células germinales diferenciadoras forman capas concéntricas de la composición de las cuales es predecible, y las células haploides en un paso dado de desarrollo siempre se asocian con ciertos tipos de espermatozoides y espermatozoides4,5. Por lo tanto, cualquier sección transversal de un tubérculo alberga cohortes de células germinales de una composición constante. Estas asociaciones celulares específicas se definen como las etapas del epitelio seminiferoso. Las etapas per se no presentan estados estancados similares a puntos de control, sino que se desarrollan continuamente a medida que avanza la diferenciación de cohortes de células germinales en sincronía1,2,6. En ratones, hay 12 etapas (I-XII)2 que se organizan de forma segmentaria a lo largo del eje longitudinal del tubérculo seminiferoso, y se siguen entre sí en un orden lógico formando así la onda de epitelio seminífero, o onda espermatogénica7,8,9 (Figura 1). La finalización de la espermatogénesis toma cuatro ciclos, y las capas jerárquicas o cohortes de células germinales diferenciadoras dentro de cualquier sección transversal de tubérculo seminiferoso son temporalmente un ciclo seminiferoso aparte unas de otras. La longitud del ciclo depende de las especies y en el ratón cada ciclo tarda 8,6 días10.
Las etapas se pueden identificar sobre la base de la composición celular y la organización del epitelio seminiferoso en testículos histológicos secciones5 (Figura 1 y Figura 2). Sin embargo, el análisis histológico es laborioso, requiere mucho tiempo y requiere fijación y tinción, y por lo tanto no se puede aplicar al tejido vivo. Es importante destacar que la puesta en escena también se puede realizar en el tejido vivo bajo un microscopio de disección aprovechando patrones distintos de absorción/dispersión de la luz exhibidos por diferentes etapas del ciclo (Figura 2). La capacidad de cada etapa para absorber y dispersar la luz es relativa al nivel de condensación de cromatina de espermatozoides post-meioticos tardíos que cualquier etapa dada aloja y el embalaje de estas células en los paquetes7,11. La diferenciación espermática, es decir,la espermatogénesis, se divide además en 16 pasos de desarrollo, incluyendo 8 pasos de espermatozoides redondos (paso 1-8) y 8 pasos de espermacia alargada (pasos 9-16) diferenciación (Figura 1). Los espermatozoides alargadores paso 9-11 (etapa IX-XI) muestran sólo un bajo nivel de condensación de cromatina que resulta en una baja cantidad de luz que se absorbe. La condensación de cromatina comienza en los espermatozoides del paso 11 (etapa XI), y los espermatozoides elongantes del paso 15-16 (etapa IV-VIII) contienen cromatina totalmente condensada y, por lo tanto, exhiben una absorción máxima de la luz(Figura 3). La cromatina necesita ser condensada para ser apretada en la cabeza del espermatozoide. Otros factores que contribuyen al patrón de absorción de la luz son la ubicación de espermatozoides alargados dentro del epitelio (basal frente a apical) y la agrupación de espermatozoides alargados (pronunciados en etapas II-V)11 (Figura 3). Los haces son vistos como manchas en el medio de los túbulos y como rayas en los bordes bajo un microscopio de disección y cuanto más condensado la cromatina, más oscura es la mancha/raya11.
En este artículo se describe el uso del método de microdissección asistido por transilluminación para el aislamiento de segmentos de tubérculos semeferosos que representan etapas específicas del ciclo epitelial seminferoso. Una vez aislados, los segmentos de tubérculos escenificados pueden estar sujetos a varios análisis posteriores, incluyendo ARN bioquímico y análisis de proteínas12,13,14,15,citometría de flujo16,cultivo de tubérculo ex vivo 17 e inmunostaining18. Aquí también proporcionamos protocolos detallados aguas abajo para preparar monocapas aplastadas de segmentos de tubérculos escenificados para análisis morfológicos de células vivas y inmunostaining posterior, así como inmunostainings de montaje completo de segmentos de tubérculos. El flujo de trabajo en pocas palabras en descrito en la figura 4.
El método de microdissección asistido por transilluminación permite una identificación y aislamiento precisos de las células germinales en pasos específicos de diferenciación gracias a la composición celular sincronizada de las etapas. Es importante destacar que también permite el estudio de eventos dependientes de la etapa durante la espermatogénesis en el tejido vivo. Dada la falta de modelos in vitro escalables para la espermatogénesis, este método también tiene una ventaja única de permitir estudios de desarrollo y toxicológicos específicos a corto plazo en segmentos de tubérculos específicos del escenario ex vivo12,17. Mientras que describimos el método aquí para el ratón, el mismo procedimiento se puede aplicar a cualquier especie de mamífero con disposición longitudinal y segmental de etapas epiteliales seminiferosas, como la rata4,7,15,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glass 20x20 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon conical tube 15-ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen (ImmEdge)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide Superfrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100-mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11503387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

La espermatogénesis es un proceso de diferenciación único que en última instancia da lugar a uno de los tipos celulares más distintos del cuerpo, el espermatozoide. La diferenciación de las células germinales tiene lugar en los bolsillos citoplasmáticos de las células sertoli somáticas que alojan de 4 a 5 generaciones de células germinales simultáneamente y coordinan y sincronizan su desarrollo. Por lo tanto, la composición de los tipos de células germinales dentro de una sección transversal es constante, y estas asociaciones celulares también se conocen como etapas (I-XII) del ciclo epitelial seminferoso. Es importante destacar que las etapas también se pueden identificar a partir de túbulos seminiferosos intactos en función de sus características diferenciales de absorción/dispersión de la luz reveladas por la transilluminación, y el hecho de que las etapas se siguen entre sí a lo largo del tubérculo en un orden numérico. En este artículo se describe un método de microdissección asistido por transilluminación para el aislamiento de segmentos de tubérculos seminiferosos que representan etapas específicas del ciclo epitelial seminiferoso del ratón. El patrón de absorción de luz de los túbulos semeferosos se inspecciona primero bajo un microscopio de disección, y luego los segmentos de tubérculos que representan etapas específicas se cortan y se utilizan para aplicaciones aguas abajo. Aquí describimos protocolos de inmunostaining para preparaciones de calabaza específicas de la etapa y para segmentos de tubérculos intactos. Este método permite a un investigador centrarse en eventos biológicos que tienen lugar en fases específicas de la espermatogénesis, proporcionando así una herramienta única para estudios de desarrollo, toxicológicos y citológicos de espermatogénesis y mecanismos moleculares subyacentes.

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Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Este protocolo describe la microdisección asistida por transilluminación de segmentos de tubulos seminiferosos de ratón adultos que representan etapas específicas del ciclo epitelial seminferoso, y los tipos celulares en el mismo, y la inmunodetención posterior de preparaciones de calabaza y segmentos de tubérculos intactos.

Disección asistida por transilluminación de etapas específicas del ciclo epitelial seminiferoso del ratón para análisis de inmunodetención aguas abajo

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

transillumination-assisted-dissection-specific-stages-mouse

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6.8K vistas.  University of Turku, Turku, Finland. Este protocolo describe la microdisección asistida por transilluminación de segmentos de tubulos seminiferosos de ratón adultos que representan etapas específicas del ciclo epitelial seminferoso, y los tipos celulares en el mismo, y la inmunodetención posterior de preparaciones de calabaza y segmentos de tubérculos intactos.

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

-Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Aislamiento de ratón endometrial epiteliales y células del estroma de<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

Grabaciones de parche de sujeción de células enteras de células epiteliales primarias aisladas del epidídimo

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Disección y cultivo de riñón embrionario de ratón

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate embryonic origins and functions &#8212; the neurohypophysis and the adenohypophysis. The developing mouse pituitary gland is tiny and delicate with an elongated oval shape. A coronal section is preferred to display both the adenohypophysis and neurohypophysis in a single slice of the mouse pituitary.
The goal of this protocol is to achieve proper pituitary coronal sections with well-preserved tissue architectures from developing mice. In this protocol, we describe in detail how to dissect and process pituitary glands properly from developing mice. First, mice are fixed by transcardial perfusion of formaldehyde prior to dissection. Then three different dissecting techniques are applied to obtain intact pituitary glands depending on the age of mice. For fetal mice aged embryonic days (E) 17.5 - 18.5 and neonates up to 4 days, the entire sella regions including the sphenoid bone, gland, and trigeminal nerves are dissected. For pups aged postnatal days (P) 5 - 14, the pituitary glands connected with trigeminal nerves are dissected as a whole. For mice over 3 weeks old, the pituitary glands are carefully dissected free from the surrounding tissues. We also display how to embed the pituitary glands in a proper orientation by using the surrounding tissues as landmarks to obtain satisfying coronal sections. These methods are useful in analyzing histological and developmental features of pituitary glands in developing mice.

We present a protocol to dissect pituitary glands and prepare pituitary coronal sections from developing mice.

Disección y preparación del segmento Coronal de desarrollo de hipófisis de ratón

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Una técnica de Squash del túbulo seminífero para el análisis citológico de la espermatogénesis mediante el modelo de ratón

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Análisis transcriptómico de unicelular de células endocrinas pancreáticas de ratón

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

Preparación de tejidos e inmunomanchación de tejidos craneofaciales de ratón y hueso no descalcificado

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

Aislamiento y tinción de queratinocitos de piel de ratón para el análisis específico del ciclo celular de la expresión de proteínacelular espora

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

Disección, cultivo y análisis de células de cresta neural craneal primarias de ratón para el estudio de la delaminación y migración de células de cresta neuronal

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...