Este protocolo demuestra que es posible inculcar material de investigación en la tráquea de crías de ratas neonatales, de cinco días de edad, mediante visualización directa. Este método mejora la fiabilidad de la administración de material de investigación o fármaco en la tráquea mediante visualización directa. Al evitar la inyección en la tráquea, este método reduce el dolor y, lo que es más importante, el sangrado en la tráquea, lo que permite una mejor supervivencia.
Se requiere el desarrollo de habilidades finas para realizar este protocolo, incluido el posicionamiento apropiado del animal, el uso correcto del autoscopio operativo para visualizar las cuerdas vocales y la eficacia de la administración en los pulmones. Demostrando el procedimiento estarán Tara Sudhadevi, becaria postdoctoral de mi laboratorio, y Alison Ha, una estudiante graduada. Antes de comenzar el experimento, confirme una pérdida del reflejo de la cola y el pedal en un cachorro de rata anestesiado de cinco días de edad y use cinta de etiquetado de laboratorio para sujetar al cachorro en posición supina en una plataforma plana inclinada a 45 grados.
Use fórceps contundentes para tirar suavemente de la lengua hacia un lado, y con la ayuda de un espéculo de otoscopio de dos milímetros de diámetro, sostenga suavemente la lengua en su lugar para que la laringe sea visible. Usando el otoscopio de operación con el espéculo del tamaño correcto, ubique las cuerdas vocales a través de la lente de aumento del otoscopio. Para la instilación intratraqueal, cargue una jeringa de un mililitro equipada con una punta de pipeta de carga en gel de ángulo largo con 0,9 centímetros cúbicos de aire, seguida de 30 a 50 microlitros de la sustancia de interés.
Doble la punta de la pipeta a un ángulo de 30 grados e inserte la punta de la pipeta cargada a través del espéculo a unos dos milímetros más allá de las cuerdas vocales. Empuje el pistón de la jeringa para administrar la sustancia de interés y el aire a través del espéculo hacia las cuerdas vocales. Cuando se haya entregado toda la sustancia, coloque al cachorro en una almohadilla térmica de fluido circulante integrada de 38 grados Celsius con monitoreo hasta la respiración regular, antes de reunir al cachorro con la presa.
Para evaluar la distribución de la sustancia dentro de una muestra de tejido pulmonar, limpie el pecho y el abdomen de las crías de rata sacrificadas con alcohol etílico al 70% y use una técnica estéril para extirpar los pulmones de acuerdo con los protocolos estándar para su evaluación visual. En este estudio, la eficacia de la técnica de instilación intratraqueal se evaluó mediante el examen visual del tejido pulmonar recogido de un cachorro de rata de cinco días de edad inculcado con tinte azul Evans. La instilación fue casi 100% eficiente, ya que el tinte se extendió al pulmón inmediatamente después de la administración y se distribuyó a través de todos los lóbulos del tejido pulmonar.
El tinte no se observó dentro de ningún tejido fuera de los pulmones, lo que confirma la capacidad de la técnica para ser utilizada para la entrega selectiva de una terapéutica de interés para los pulmones. Colocar al animal inicialmente en el ángulo correcto sobre una superficie firme es esencial para el éxito del siguiente paso de visualizar las cuerdas vocales utilizando el autoscopio operativo.
