Questo protocollo dimostra che è possibile instillare materiale di ricerca nella trachea di cuccioli di ratto neonatale, di cinque giorni, mediante visualizzazione diretta. Questo metodo migliora l'affidabilità della somministrazione di materiale di ricerca o farmaco nella trachea mediante visualizzazione diretta. Evitando l'iniezione nella trachea, questo metodo riduce il dolore e, cosa più importante, il sanguinamento nella trachea, consentendo una migliore sopravvivenza.
Lo sviluppo di abilità fini è necessario per eseguire questo protocollo, compreso il posizionamento appropriato dell'animale, l'uso corretto dell'autoscopio operativo per visualizzare le corde vocali e l'efficacia della somministrazione nei polmoni. A dimostrare la procedura saranno Tara Sudhadevi, una borsista post-dottorato del mio laboratorio, e Alison Ha, una studentessa laureata. Prima di iniziare l'esperimento, confermare una perdita di riflesso della coda e del pedale in un cucciolo di ratto anestetizzato di cinque giorni e utilizzare il nastro adesivo di laboratorio per trattenere il cucciolo in posizione supina su una piattaforma piatta inclinata a 45 gradi.
Utilizzare una pinza smussata per tirare delicatamente la lingua da un lato e, con l'aiuto di uno speculum otoscopico di due millimetri di diametro, tenere delicatamente la lingua in posizione in modo che la laringe sia visibile. Utilizzando l'otoscopio operativo con lo speculum di dimensioni corrette, individuare le corde vocali attraverso la lente d'ingrandimento dell'otoscopio. Per l'instillazione intratracheale, caricare una siringa da un millilitro dotata di una punta di pipetta ad angolo lungo e gel con 0,9 centimetri cubici di aria, seguita da 30-50 microlitri della sostanza di interesse.
Piegare la punta della pipetta con un angolo di 30 gradi e inserire la punta della pipetta caricata attraverso lo speculum a circa due millimetri oltre le corde vocali. Spingere il pistone della siringa per somministrare la sostanza di interesse e l'aria attraverso lo speculum nelle corde vocali. Quando tutta la sostanza è stata consegnata, posizionare il cucciolo su una piastra riscaldante a fluido circolante integrata a 38 gradi Celsius con monitoraggio fino alla respirazione regolare, prima di riunire il cucciolo con la diga.
Per valutare la distribuzione della sostanza all'interno di un campione di tessuto polmonare, pulire il torace e l'addome dei cuccioli di ratto eutanasizzati con alcol etilico al 70% e utilizzare una tecnica sterile per rimuovere i polmoni secondo protocolli standard per la loro valutazione visiva. In questo studio, l'efficacia della tecnica di instillazione intra-tracheale è stata valutata mediante esame visivo del tessuto polmonare raccolto da un cucciolo di ratto di cinque giorni instillato con colorante blu Evans. L'instillazione è stata quasi efficiente al 100%, poiché il colorante si è diffuso nel polmone immediatamente dopo la somministrazione e distribuito su tutti i lobi del tessuto polmonare.
Il colorante non è stato osservato all'interno di alcun tessuto esterno ai polmoni, confermando la capacità della tecnica di essere utilizzata per la consegna selettiva di una terapia di interesse per i polmoni. Posizionare l'animale inizialmente all'angolo corretto su una superficie solida è essenziale per il successo della fase successiva di visualizzazione delle corde vocali utilizzando l'autoscopio operativo.
