A.J.C, J.A.T e I.L reconocen la financiación de la Comisión Europea a través del proyecto Horizonte 2020 ACEnano (Subvención no. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z reconoce la financiación de doctorado del Consejo de Becas de China (CSC, No. 201507060011). R.R reconoce el apoyo financiero del programa de subvenciones Vidi de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO Vidi 723.0160330).

El uso de biofluidos humanos fue aprobado según las pautas del protocolo IRB de la Universidad de Leiden y la Universidad Médica de Innsbruck. Cuando se investigan biofluidos humanos o animales, se requiere la aprobación ética de la institución de investigación, y se ha obtenido en el caso de los resultados mostrados en este protocolo. Además, también deben realizarse informes adecuados para garantizar la transparencia y la reutilización de los datos en los trabajos futuros9,29,30.
1. Preparación de electrolitos de fondo (BGE)
NOTA: Todos los disolventes deben prepararse en una campana de humos adecuada y se debe usar equipo de protección personal adecuado para todos los pasos (bata de laboratorio, guantes y gafas). En cada paso, se requieren viales de plástico de baja unión para minimizar la pérdida de analitos y la contaminación de la muestra con sales lixiviadas de la cristalería.
<ol><li>Preparar 10% de ácido acético BGE (v/v), pH 2.2 diariamente para la metabolómica.<ol>
<li>En un matraz amétrico de 10 ml agregue 1 ml de ácido acético, seguido de la adición de agua desionizada (DI) a la línea marcada y una mezcla completa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 100 mM de ácido acético, pH 2.9 diariamente para la proteómica.<ol>
<li>En un matraz amétrico de 10 ml agregue 57 μL de ácido acético, seguido de la adición de agua DI a la línea marcada y una mezcla completa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación NM
<ol><li>Dispersar vigorosamente los NM en el agua utilizando las directrices publicadas31,32,33. NOTA: En el desarrollo de este protocolo, se utilizaron 7 NM de la siguiente manera: se utilizó poliestireno carboxilado de 100 y 1.000 nm para la proteína y el metabolito corona, respectivamente. Se utilizaron NM de poliestireno no modificados de 100 nm, NM de anatasa TiO2 de 13 nm que no se modificaron o recubrieron con polímeros de poliacrilato o PVP y NM de SiO 2 sin modificarde 22 nm para coronas de proteínas y metabolitos. Si bien el método se desarrolló y demostró utilizando estos NM, debe tenerse en cuenta que este enfoque sería aplicable a una amplia gama de composiciones, tamaños, formas y morfologías de NM.</li>
	<li>Caracterizar el tamaño de partícula utilizando dispersión dinámica de luz34,35,espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente a partículas individuales36,análisis de seguimiento de nanopartículas37,o microscopía electrónica de transmisión y carga superficial como potencial zeta utilizando un escalador zeta34.</li>
</ol>3. Formación de corona biomolecular
<ol><li>Divida 2 ml de plasma humano (o biofluido de elección) en alícuotas de 1 ml, una para el metabolito y la proteína corona y la segunda para la caracterización del metaboloma plasmático.</li>
	<li>Incubar 1 mg/ml de NM en el plasma humano durante 1 h a 37 °C mientras se mezcla suavemente a 500 rpm en un termomezclador. Después de la incubación, centrífuga la muestra a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C para gletizar los NM.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante plasmático para el análisis de la corona del metabolito. Retener el complejo corona de proteína NM para la caracterización de la corona de proteína.</li>
</ol>4. Aislamiento de proteínas corona
<ol><li>Resuspend el complejo DE PROTEÍNA NM (el pellet) en 1 ml de 10x PBS Buffer y vórtice vigorosamente durante 2 min para eliminar las proteínas no unidas. Centrifugar la solución de PBS a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C para peletizar los NM, y retirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet.</li>
	<li>Resuspend el pellet en 1 mL de tampón de bicarbonato de amonio (ABC) (100 mM, pH 8.0) y vórtice vigorosamente durante 2 min para eliminar las proteínas no unidas y las sales no deseadas. Centrifugar a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C para gletizar los NM; retire y deseche el sobrenadante. Repita este paso.</li>
	<li>Reducir los enlaces disulfuro de proteína disolviendo el pellet de proteína NM en 20 μL de tampón ABC (100 mM pH 8) que contiene 10 mM de ditioteritol. Incubar la solución reductora durante 30 min a 56 °C.</li>
	<li>Para digerir las proteínas, agregue 2 μg de tripsina de grado de secuenciación a 20 μL de ABC que contengan 0.1% de surfactante. Incubar la solución digesto durante 16 h a 37 °C.</li>
	<li>Alquilar la muestra mediante la adición de 20 μL de yodoacetamida a 55 mM en ABC de 100 mM e incubar a temperatura ambiente durante 20 min.</li>
	<li>Añadir 20 μL de 0,1 M HCl para escindir el surfactante y dejar actuar durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Enriquezca y desalar péptidos usando una punta de pipeta desalineada empaquetada C18.<ol>
<li>Humedezca la punta con 80 μL 0.1% de ácido fórmico 50% acetonitrilo 5 veces, limpie con 80 μL 0.1% de ácido fórmico 5 veces, extraiga y elute la muestra 10 veces, desalte la muestra enjuagando 80 μL 0.1% de ácido fórmico 5 veces y elute la muestra 2 veces con 80 μL 0.1% de ácido fórmico 70% acetonitrilo en un tubo limpio de PCR de baja unión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Liofilizar las muestras y conservar a -20 °C hasta su análisis.</li>
</ol>5. Aislamiento de la corona del metabolito
<ol><li>Tome el plasma de control y el sobrenadante de la incubación de plasma NM del Paso 3.3 y manténgalo en hielo durante la preparación de la muestra.</li>
	<li>Tome 50 μL de cada uno en viales separados y diluya 1 de cada 10 con agua DI. Tome 50 μL de cada muestra diluida y pase a nuevos viales para el paso 5.3.</li>
	<li>Agregue 200 μL de cloroformo, 250 μL de metanol y 350 μL de agua DI y vigorosamente la mezcla de vórtice durante 2 min. Centrifugar durante 10 min a 20.800 x g a 4 °C.</li>
	<li>Tomar 500 μL de sobrenadante y filtrar a través de un filtro centrífugo de 3 kDa durante 2 h a 10.000 x g a 4 °C. Tomar 430 μL de ultrafiltrado y secar en una aspiradora de velocidad. Las muestras ahora se pueden congelar antes del análisis.</li>
</ol>6. Preparación del sistema CESI-MS38
NOTA: Antes de la instalación de los capilares, compruebe que la entrada y el extremo de salida de los capilares estén intactos y que no haya roturas visibles en el capilar.
<ol><li>Instalación de un capilar de recubrimiento neutro para análisis de proteínas corona39.<ol>
<li>Coloque un nuevo capilar recubierto neutro (90 cm de longitud con 30 μm de diámetro interno) en el instrumento CESI siguiendo las directrices del fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de capilares CESI para análisis proteómico.<ol>
<li>Enjuague el capilar de separación en la dirección hacia adelante usando 100 mM de HCl durante 5 min a 100 psi y verifique la formación de gotas en la salida del capilar. Enjuague el capilar de separación con BGE a 100 psi durante 10 min y luego agua DI a 100 psi durante 30 min (esto solo se requiere para capilares nuevos).</li>
		<li>Enjuague tanto el capilar de separación como el capilar conductor con BGE a 90 psi durante 5 minutos y asegúrese de que se formen gotas en el extremo de salida de ambos capilares.</li>
		<li>Enjuague el capilar de separación con agua DI a 90 psi durante 10 min, luego 50 psi durante 10 min con 0.1 M HCl, seguido nuevamente por 90 psi durante 10 min con agua DI y finalmente BGE a 90 psi durante 10 min. Acopla CESI al MS usando una fuente de nanospray y un adaptador como se describió anteriormente38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Instalación de capilar de sílice fundida desnuda para caracterización de metabolito corona38.<ol>
<li>Coloque un nuevo capilar de sílice fundido desnudo (90 cm de longitud con un diámetro interno de 30 μm) en el instrumento CESI siguiendo las pautas del fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de capilares CESI para análisis metabolómico.<ol>
<li>Enjuague el capilar de separación en la dirección hacia adelante usando 100% MeOH a 50 psi durante 15 min y verifique la formación de gotas en la salida del capilar. Enjuague tanto el capilar de separación como el capilar conductor con BGE a 90 psi durante 5 minutos y asegúrese de que se formen gotas en la salida de ambos capilares.</li>
		<li>Enjuague el capilar de separación con agua DI a 90 psi durante 10 min, luego 50 psi durante 10 min con 0.1 M NaOH, seguido nuevamente por 90 psi durante 10 min con agua DI y finalmente BGE a 90 psi durante 10 min. Acopla CESI al ESI-MS usando una fuente de nanospray y un adaptador como se describió anteriormente. 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS para el análisis de proteínas corona
<ol><li>Muestras de resuspend del paso 4.8 en 20 μL de 50 mM de acetato de amonio pH 4.0.</li>
	<li>Realizar 5 psi 10 s de inyección hidrodinámica de muestra. Separe utilizando un voltaje de separación de 30 kV con el siguiente gradiente de presión: 0-10 min a 1 psi, 10-35 min a 1.5 psi y 35-45 min a 5 psi usando 100 mM, pH 2.9 ácido acético como BGE.</li>
	<li>Recopile espectros de masas entre 250-2000 m/z con la adquisición de fragmentación dependiente de los 10 datos principales.</li>
	<li>Entre muestras, enjuague capilar con 0,1 M HCl durante 3 min a 100 psi y 10 min 100 psi de BGE para separación capilar y durante 3 min a 100 psi para el capilar líquido conductor.</li>
</ol>8. CESI-MS para el análisis de la corona de metabolitos
NOTA: Todas las muestras deben analizarse dos veces, una en modo positivo para la detección de cationes y una vez en modo negativo para la detección de aniones. Las muestras de plasma de control deben analizarse al menos 5 veces.
<ol><li>Resuspend NM expuesto y no expuesto muestras de plasma del paso 5.4 en 430 μL de agua DI y vórtice vigorosamente durante 2 min. Filtrar a través de un filtro de membrana de 0,1 μm.</li>
	<li>Tomar 95 μL de filtrado y añadir 5 μL de normas internas a 200 μM para cationes (L-metionina sulfona) y 400 μM para aniones (ácido 2,2,4,4-D4-cítrico) y vórtice vigorosamente. Centrifugar a 4.000 x g a 4 °C durante 10 min antes del análisis CESI-MS.</li>
	<li>Inyecte la muestra hidrodinámicamente durante 30 s (cationes) y 40 s (aniones) a 2 psi.</li>
	<li>Metabolitos separados en ácido acético al 10% con un voltaje de separación de 30 kV en modo hacia adelante (cationes) y hacia atrás (aniones). El modo de separación inversa se ayuda con una presión de avance de 0,5 psi en el capilar de separación.</li>
	<li>Configure el espectrómetro de masas para recopilar datos en modo positivo (cationes) o negativo (aniones) en el rango de masas 65-1000 m / z. Entre muestras, enjuague capilarmente con 0.1 M HCl, 0.1 M NaOH, agua DI y BGE a 50 psi durante 2 min.</li>
</ol>

J.A.T es un empleado de AB Sciex UK Ltd que participa como socio de la industria en el proyecto ACEnano, J.A.T y todos los demás autores no tienen conflicto de intereses en este trabajo.

Este es el primer método propuesto para caracterizar la corona biomolecular completa incorporando proteínas y metabolitos, a partir de la misma muestra, utilizando CESI-MS. La capacidad de caracterizar tanto las proteínas como los metabolitos de la misma muestra aumentará significativamente la cantidad de datos recopilados de una sola exposición experimental, lo que permitirá nuevos conocimientos sobre el proceso de formación de corona y sus impactos para la toxicidad y eficacia de los NM como nanomedicamentos. Además, CESI-MS es una plataforma ideal para caracterizar ambas clases de biomoléculas con solo un cambio de capilar requerido. En el futuro, los nuevos métodos desarrollados para la CE no acuosa permitirán que la lipidómica se realice utilizando CE-MS40, por lo que ahora es posible analizar proteínas, metabolitos y lípidos utilizando una sola plataforma. Los enfoques convencionales actuales requerirían dos plataformas LC-MS dedicadas, una para la proteína corona y otra para el metabolito corona. Por lo tanto, este enfoque puede recopilar el doble de datos utilizando una sola plataforma analítica.
Hay algunas advertencias a este enfoque, particularmente con el metabolito corona, ya que este protocolo propone una medición indirecta de la corona. Como tal, el problema puede surgir cuando los niveles de metabolitos están presentes en altas concentraciones en relación con los NM y la posterior caída en la concentración de metabolitos en la matriz es pequeña. Sin embargo, a diferencia de la proteína corona, es poco probable que se desarrolle un enfoque de "talla única" para aislar el metabolito corona debido a que cada NM tiene químicas de superficie únicas. Sin embargo, en el futuro es más probable que se desarrollen y validen enfoques específicos de NM para aislar el metabolito corona; esto será aplicable solo a ese NM específico. A pesar de esto, el CESI-MS seguirá siendo una plataforma muy adecuada para la caracterización de los metabolitos con carga polar independientemente de cómo estén aislados. También cabe destacar que si no se forma un pellet durante los pasos de centrifugación diseñados para peletizar los NM, se puede requerir una fuerza centrífuga más alta; esto es más probable que ocurra con NM menos densos. También es fundamental que todos los pasos de filtrado se cumplan dentro del protocolo debido al estrecho orificio de los capilares, estos pueden bloquearse fácilmente si alguna partícula no se ha eliminado adecuadamente de la muestra.
Si bien la proteína corona ha sido un área intensa de investigación durante varios años, la capacidad de combinarla con el metabolito corona es un nuevo campo de interés para los científicos que investigan la interfaz bio-nano6,14. Hasta la fecha, la mayoría de estos estudios se han centrado en la fracción lipídica no polar del metabolito corona9,28. Este método actual permite la caracterización de los metabolitos altamente polares y cargados en la corona, que incluye metabolitos importantes involucrados en el metabolismo energético, la glucólisis y la síntesis de ADN. Como resultado, cuando se combina con el flujo de trabajo de proteómica, es posible una caracterización más holística de la corona biomolecular. Esto permite un análisis más profundo de las interacciones bio-nano en el futuro. Este método permite una mayor comprensión mecanicista de la endocitosis mediada por receptores a través de interacciones de proteínas y metabolitos con receptores de membrana. Además, se pueden explorar las interacciones inter e intra corona entre proteínas y moléculas pequeñas; por ejemplo, recientemente se ha demostrado que las proteínas de la corona juegan un papel clave en el reclutamiento de metabolitos15. Vale la pena señalar que los resultados representativos en la Figura 3 y la Figura 4 son la cuantificación absoluta de los metabolitos, sin embargo, un enfoque no dirigido que utilice el análisis de datos multivariante para comparar todas las características de CE-MS en los controles en comparación con el plasma expuesto también dilucidaría la unión a metabolitos. Por lo tanto, existe un margen significativo para investigar cómo, y cuáles, los metabolitos y proteínas influyen en su respectivo reclutamiento en las coronas NM. Estos estudios adicionales pueden ayudar a diseñar coronas para optimizar la administración de nanomedicamentos o descubrir más obstáculos para su desarrollo, como la supresión de la acción farmacéutica debido al bloqueo biomolecular de la corona o las funcionalidades de enmascaramiento dirigidas.
CESI-MS con sus caudales a nanoescala de alrededor de 20 nL/min y el uso mínimo de disolventes orgánicos ofrece una mejora en las credenciales ecológicas y económicas sobre el estándar LC-MS y nanoLC-MS en términos de uso de disolventes, los principales desafíos para los estudios de metabolómica y proteómica, respectivamente. CESI-MS ofrece resultados altamente reproducibles tanto para el tiempo de migración como para el área pico que se comparan favorablemente con los métodos basados en LC-MS11,15. Además, en comparación con nanoLC-MS, el arrastre no es un problema en CESI-MS. Por lo tanto, no se requiere una limpieza exhaustiva del sistema entre los análisis de muestras, lo que mejora en gran medida el rendimiento de la muestra11.
En resumen, el flujo de trabajo propuesto es el primero en detallar un enfoque para caracterizar los componentes de proteínas y metabolitos de la corona biomolecular completa de los NM. Esto desbloquea un nuevo aspecto de las interacciones bio-nano, el metabolito corona, lo que permite la recopilación del doble de datos de la misma muestra, lo que permite una comprensión más completa de las interacciones en la interfaz bio-nano.

Las interacciones bio-nano, en la interfaz entre las superficies de nanomateriales (NM) y las matrices biológicas a partir de las cuales las biomoléculas se adsorben al NM, es un área intensa de investigación que sustenta la nanoseguridad y la nanomedicina1. Esta capa de biomoléculas adsorbidas confiere una identidad biológica a las NM, por lo que las células las identifican como "propias", influyendo posteriormente en la captación celular, distribución y puntos finales biológicos2,3,4. La gran mayoría de los estudios bio-nano se han centrado en las proteínas dentro de la corona, y han demostrado que las proteínas varían cuantitativa y cualitativamente entre NM de diferentes composiciones5. Esta variación depende tanto de las propiedades del NM como del tamaño, la funcionalización y el material, además de las propiedades de la matriz biológica, incluida la composición y el contenido de sal5. Un área de interés creciente en la interfaz bio-nano son los metabolitos que se adsorben a los NM6. Varios estudios han demostrado que, al igual que con las proteínas, las propiedades nm son un factor clave para determinar la composición de los metabolitos en la corona y que pueden influir en los resultados biológicos de la exposición a NM6,7,8.
En los estudios de la corona biomolecular existen cuatro fases distintas para su caracterización, la formación de corona, el aislamiento de las biomoléculas dentro de la corona, su detección mediante espectrometría de masas cualitativa o cuantitativa y la identificación9. Hasta la fecha, se han adoptado una serie de técnicas para aislar la proteína corona, incluida la ebullición en tampón SDS-PAGE, extracciones de solvente y sal o digestión directa de proteínas in situ en la superficie de los NM. En cuanto a los metabolitos en la corona, el aislamiento es más complejo con diversos métodos utilizando disolventes o incluso la disolución de los NM propuestos como soluciones8,10,11. Sin embargo, a diferencia de la proteína corona, es poco probable que se aplique un enfoque de "talla única" al aislamiento de metabolitos de NM, debido al amplio espacio químico ocupado por el metaboloma y la diversidad de posibles NM. Un enfoque alternativo es caracterizar la matriz biológica antes y después de la exposición a NM con la diferencia en las concentraciones de metabolitos atribuidas a la adsorción de metabolitos a NM.12
Este enfoque alternativo sería aplicable a todos los biofluidos y NM y, aunque requiere el doble de análisis, en consecuencia ofrece una medida mucho más precisa del metabolito corona y no tiene riesgo de que las recuperaciones de metabolitos bajos de la superficie NM se confundan con una baja unión del metabolito específico.
El segundo paso para el análisis biomolecular de la corona es la detección de las biomoléculas. Tradicionalmente para las proteínas en la corona, este ha sido el mandato de nano-LC-MS, el caballo de batalla de la proteómica; también se han aplicado otros enfoques como NMR13,1D y 2D SDS-PAGE. En cuanto al metabolito corona LC-MS7,GC-MS8 y espectrometría de masas de infusión directa se han utilizado14. Sin embargo, un nuevo enfoque ha comenzado recientemente a ganar tracción, a saber, la electroforesis capilar-espectrometría de masas (CE-MS)11,15 y ha estado presente en los laboratorios nm como una técnica independiente para caracterizar diversas propiedades físicas y químicas de los NM16. CE-MS es una técnica de separación ortogonal a nanoLC-MS y GC-MS y es capaz de permitir la detección de metabolitos altamente polares y cargados17,18. Además, CE-MS es muy adecuado para el análisis de proteínas y sus modificaciones posttraduccionales como la fosforilación y la glicosilación19,20,21,22. El paso final, la identificación y el análisis de datos se pueden realizar de varias maneras dependiendo de si se está utilizando un enfoque cuantitativo / cualitativo o dirigido / no dirigido, esto, sin embargo, queda fuera del ámbito de este protocolo.
CESI-MS, una combinación de CE y una interfaz nanoESI, es un avance reciente en la tecnología CE que utiliza una interfaz sin vase. Esto permite la conexión directa de CE de flujo ultra bajo (<20 nL / min) a un espectrómetro de masas de alta resolución sin dilución, lo que resulta en una sensibilidad de detección significativamente mejorada23,24,25. CESI-MS permite analizar muestras de volumen limitado (< 10 μL) manteniendo un análisis altamente sensible26. CESI-MS también se compara favorablemente con los enfoques tradicionales de nanoLC-MS de bajo caudal utilizados en proteómica y metabolómica en términos de reproducibilidad27,28, rendimiento y arrastre, lo que lo convierte en una perspectiva emocionante para la caracterización completa de la corona biomolecular.
Para resaltar el potencial de CESI-MS para los análisis de interacciones bio-nano, este trabajo describe la preparación de muestras requerida para aislar la corona biomolecular NM de una sola muestra de plasma humano de tal manera que maximice los datos de los aspectos proteicos y metabolitos de la corona NM biomolecular completa. Si bien informamos sobre el uso de plasma humano, este protocolo sería igualmente apropiado para otros biofluidos como el suero sanguíneo, el medio de cultivo celular completo, el lisato celular, el líquido cefalorraquídeo o la orina. Los análisis de estos dos componentes (proteínas y metabolitos) se describirán utilizando capilares CESI recubiertos neutros para la proteína corona y capilares de sílice fusionados desnudos para metabolitos catiónicos y aniónicos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,4,4-D4-citric</td>
			<td>Simga</td>
			<td>485438-1G</td>
			<td>Internal standard anion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge coolant</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>359976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 instrument</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>A98089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Cap</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B24699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Vials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650498</td>
			<td>Toxic, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 1mol/L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iosoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine sulfone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0876-1G</td>
			<td>Internal standard cation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14262</td>
			<td>Use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoVials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5043467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Surface Cartridge 30 &#181;M ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07363</td>
			<td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &#181;m ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahte buffered saline 10x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips, 100 &#181;L bed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>16688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>08226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapigest SF (surfactant)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiO2 Ludox TM-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>420786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide solution</td>
			<td>Simga</td>
			<td>72079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 Dispex coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 PVP coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 uncoated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

La adsorción de biomoléculas de las matrices biológicas circundantes a la superficie de los nanomateriales (NM) para formar la corona ha sido de interés durante la última década. El interés en la interfaz bio-nano surge del hecho de que la corona biomolecular confiere una identidad biológica a los NM y, por lo tanto, hace que el cuerpo los identifique como "propios". Por ejemplo, estudios previos han demostrado que las proteínas en la corona son capaces de interactuar con los receptores de membrana para influir en la captación celular y han establecido que la corona es responsable del tráfico celular de NM y su eventual toxicidad. Hasta la fecha, la mayoría de las investigaciones se han centrado en la proteína corona y han pasado por alto los posibles impactos de los metabolitos incluidos en la corona o los efectos sinérgicos entre los componentes de la corona biomolecular completa. Como tal, este trabajo demuestra metodologías para caracterizar los componentes proteicos y metabolitos de la corona biomolecular utilizando enfoques de proteómica y metabolómica de abajo hacia arriba en paralelo. Esto incluye una digestión en partícula de la proteína corona con un surfactante utilizado para aumentar la recuperación de proteínas, y una caracterización pasiva del metabolito corona mediante el análisis de matrices de metabolitos antes y después de las exposiciones a NM. Este trabajo introduce la electroforesis capilar – espectrometría de masas (CESI-MS) como una nueva técnica para la caracterización de la corona NM. Los protocolos descritos aquí demuestran cómo CESI-MS se puede utilizar para la caracterización confiable de la proteína y el metabolito corona adquiridos por los NM. El cambio a CESI-MS disminuye en gran medida el volumen de muestra requerido (en comparación con los enfoques tradicionales de cromatografía líquida – espectrometría de masas (LC-MS)) con múltiples inyecciones posibles desde tan solo 5 μL de muestra, lo que lo hace ideal para muestras de volumen limitado. Además, las consecuencias ambientales del análisis se reducen con respecto a LC-MS debido a los bajos caudales (<20 nL/min) en CESI-MS, y al uso de electrolitos acuosos que eliminan la necesidad de disolventes orgánicos.

El método descrito es el primero en caracterizar tanto las proteínas como los metabolitos en la corona biomolecular NM utilizando la misma muestra de plasma humano. Este método es capaz de detectar >200 proteínas y metabolitos >150, lo que permite determinar la visión general más completa de la corona biomolecular completa, lo que permite una mejor comprensión de la unión celular NM, la absorción y los impactos.
El uso de CESI-MS tanto para la separación y detección de proteómica(Figura 1)como para metabolómica(Figura 2)muestra buenas ventanas de separación en ambos capilares para cada abordaje.
Este método es capaz de distinguir entre las proteínas de la corona a través de una amplia gama de composiciones de NM, demostrando así la aplicabilidad de los métodos a las NM a través de una amplia gama de características físicas y químicas (Tabla 1).
Las huellas dactilares únicas del metabolito corona también se pueden distinguir utilizando la rama metabolómica de esta metodología (Figura 3). Aunque este enfoque utiliza un enfoque pasivo para caracterizar el metabolito NM corona, todavía es capaz de descubrir ideas interesantes sobre el papel de los metabolitos en la corona biomolecular, como la adsorción diferencial de isómeros(Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Figura 1: Electroferograma ejemplar de una separación de corona de proteína SiO2 utilizando CESI-MS después de una digestión en partícula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Figura 2: Ejemplo de electroferogramas iónicos extraídos obtenidos de compuestos endógenos en plasma por CE-MS. Los compuestos numerados son los siguientes: 1. Ornitina; 2. Lisina; 3. Arginina; 4. Histidina; 5. Creatina; 6. Glicina; 7. Alanina; 8. Valina; 9. Isoleucina; 10. Leucina; 11. Serina; 12. Treonina; 13. Asparagina; 14. Metionina; 15. Glutamina; 16. Ácido glutámico; 17. Fenil-D5-alanina; 18. Fenilalanina; 19. Tirosina; 20. Prolina; 21. Metionina sulfona (estándar interno). Publicado bajo una licencia Creative Commons CC BY de acceso abierto y reproducido de Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Análisis de la proteína corona en una matriz de 6 NM. Mapa de calor de las clases de proteínas identificadas en sílice (SiO2),titania (TiO2),titania con tapa de PVP (TiO2-PVP), titania con tapa de dispex (TiO2-Dispex), poliestireno y NM de poliestireno carboxilado. Los porcentajes se refieren a la abundancia de proteínas en relación con el contenido total de proteínas en función de la abundancia de 3 péptidos principales para cada proteína. Dadas las diferencias observadas en las abundancias relativas de proteínas en las diferentes coronas NM, está claro que este protocolo propuesto es lo suficientemente sensible como para diferenciar entre la proteína corona de diferentes NM. Figura reproducida a partir de un análisis CESI-MS de la proteína corona, publicado bajo una licencia Creative Commons CC BY de acceso abierto11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Figura 3: Análisis dirigido de los metabolitos catiónicos en la corona NM. Adsorción de cationes a Los NM de SiO2 y TiO2. El rojo se refiere a la concentración inicial de metabolitos, mientras que el azul se refiere a la concentración de metabolitos después de una incubación de 1 h con los NM a 37 °C. La reducción en la concentración de metabolitos en la solución es el resultado de la adsorción de metabolitos a la superficie NM. No se observó una adsorción significativa de metabolitos para los NM de poliestireno. Los diagramas de caja representan los valores mínimo y máximo, los rangos de mediana e intercuartílico. Figura reproducida de un análisis dirigido CESI-MS del metabolito corona publicado bajo una licencia Creative Commons CC BY de acceso abierto15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Figura 4: Análisis dirigido de los metabolitos aniónicos en la corona NM con un enfoque en la adsorción de isómeros. La adsorción de aniones a una gama de NM de titania muestra claras diferencias entre varios isómeros, como los fosfatos de azúcar. El rojo se refiere a la concentración inicial de metabolitos, mientras que el azul se refiere a la concentración de metabolitos después de una incubación de 1 h con el NM a 37 °C. La reducción en la concentración de metabolitos en solución es el resultado de la adsorción de metabolitos a la superficie NM. No se observó una adsorción significativa de metabolitos para el SiO2 y los NM de poliestireno. Las gráficas de caja representan los valores mínimo y máximo, los rangos de mediana e intercuartílico. Figura reproducida de un análisis dirigido por CESI-MS del metabolito corona publicado bajo una licencia Creative Common CC BY de acceso abierto15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analito</td>
			<td>Área media de pico de RSD</td>
			<td>Tiempo medio de migración de RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>Péptidos de 1928 intradía (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cationes intradía (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cationes entre días (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Reproducibilidad de réplicas técnicas de CESI-MS para péptidos y metabolitos catiónicos. DSR: desviación estándar relativa, como medida de reproducibilidad. La reproducibilidad de CESI-MS en términos de áreas pico y tiempos de migración es muy buena, con todos los analitos con una RSD media <15% y tiempos de migración <2,2%. Estos resultados demuestran el alto grado de confianza que se puede atribuir a los datos recopilados mediante esta técnica y confirman que las variaciones detectadas se deben a diferencias genuinas en la composición de la muestra (enriquecimiento en NM) más que a la variación analítica. La Tabla 2 se genera a partir de los resultados presentados anteriormente11,15.

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Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Aquí presentamos un protocolo para caracterizar la corona biomolecular completa, proteínas y metabolitos, adquiridos por nanomateriales a partir de biofluidos utilizando un enfoque de electroforesis capilar – espectrometría de masas.

Electroforesis capilar Enfoques de espectrometría de masas para la caracterización de la proteína y el metabolito Corona adquiridos por nanomateriales

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-approaches-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

4.2K vistas.  University of Birmingham. Aquí presentamos un protocolo para caracterizar la corona biomolecular completa, proteínas y metabolitos, adquiridos por nanomateriales a partir de biofluidos utilizando un enfoque de electroforesis capilar – espectrometría de masas.

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Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

El análisis de dinámica de proteínas utilizando hidrógeno Intercambio de Espectrometría de Masas

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Investigación

Química

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Espectrometría de masas enfoque para estudiar la estructura de la proteína y las interacciones en liofilizadas Polvos

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Utilizando electroforesis capilar para cuantificar ácidos orgánicos a partir de Tejidos Vegetales: Un caso de prueba del examen<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Semillas

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Un ensayo de HS-MRM para la cuantificación de las proteínas de la célula huésped en productos biofarmacéuticos de proteínas por cromatografía líquida QTOF masa espectrometría por movilidad iónica

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Análisis de la respiración en tiempo real mediante el uso de ionización secundaria Nanoelectrospray acoplada a espectrometría de masas de alta resolución

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Síntesis y análisis de espectrometría de masas de peptoides Oligo

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Microsondeo electrónico capilar electroforesis de espectrometría de masas para unicelular metabolómica en embriones de Rana viva (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Análisis de arquitecturas de proteínas y complejos de proteína-ligando por espectrometría de masa estructural integrativo

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Proteómica de arriba hacia abajo a gran escala mediante electroforesis capilar de zona Spectrometry total en tándem

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Alto rendimiento y amplio farmacovigilancia mediante espectrometría de masas siguientes electroforesis capilar de inyección

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...