A.J.C, J.A.T et I.L reconnaissent le financement de la Commission européenne via le projet Horizon 2020 ACEnano (Grant no. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z reconnaît le financement du doctorat du China Scholarship Council (CSC, n° 201507060011). R.R reconnaît le soutien financier du programme de subventions Vidi de l’Organisation néerlandaise de la recherche scientifique (NWO Vidi 723.0160330).

L’utilisation de biofluide humain a été approuvée conformément aux directives du protocole IRB de l’Université de Leiden et de l’Université de médecine d’Innsbruck. Lorsque des biofluides humains ou animaux sont étudiés, l’approbation éthique de l’établissement de recherche est requise et a été obtenue dans le cas des résultats présentés dans le présent protocole. En outre, des rapports adéquats devraient également être effectués pour assurer la transparence et la réutilisation des données dans les travauxfuturs9,29,30.
1. Préparation des électrolytes de fond (BGE)
REMARQUE: Tous les solvants doivent être préparés dans une hotte appropriée et un équipement de protection individuelle adéquat doit être utilisé pour toutes les étapes (blous de laboratoire, gants et lunettes). À chaque étape, des flacons en plastique à faible liant sont nécessaires pour minimiser la perte d’analyte et la contamination de l’échantillon par les sels lessivés de la verrerie.
<ol><li>Préparer 10% d’acide acétique BGE (v / v), pH 2,2 sur la base quotidienne pour la métabolomique.<ol>
<li>Dans une fiole jaugée de 10 mL, ajouter 1 mL d’acide acétique, suivi de l’ajout d’eau désionisée (DI) à la ligne marquée et d’un mélange approfondi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer 100 mM d’acide acétique, pH 2,9 par jour pour la protéomique.<ol>
<li>Dans une fiole jaugée de 10 mL, ajouter 57 μL d’acide acétique, suivi de l’ajout d’eau DI à la ligne marquée et d’un mélange minutieux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation du NM
<ol><li>Disperser vigoureusement les NM dans l’eau en utilisant les lignes directrices publiées31,32,33. REMARQUE: Dans le développement de ce protocole, 7 NM ont été utilisés comme suit: 100 et 1 000 nm de polystyrène carboxylé ont été utilisés pour la couronne de protéines et de métabolites, respectivement. Des NM de polystyrène non modifiés de 100 nm, des NM d’anatase TiO2 de 13 nm qui n’ont pas été modifiés ou recouverts de polymères polyacrylate ou PVP et 22 nm de NM SiO2 non modifiés ont été utilisés pour les couronnes de protéines et de métabolites. Bien que la méthode ait été développée et démontrée à l’aide de ces NM, il convient de noter que cette approche serait applicable à un large éventail de compositions, de tailles, de formes et de morphologies de NM.</li>
	<li>Caractériser la taille des particules en utilisant soit la diffusion dynamique de la lumière34,35, la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif à particule unique36, l’analyse de suivi des nanoparticules37, soit la microscopie électronique à transmission et la charge de surface comme potentiel zêta à l’aide d’une taille zeta34.</li>
</ol>3. Formation de couronnes biomoléculaires
<ol><li>Diviser 2 mL de plasma humain (ou biofluide de choix) en aliquotes de 1 mL, l’une pour le métabolite et la couronne protéique et la seconde pour la caractérisation du métabolome plasmatique.</li>
	<li>Incuber 1 mg/mL de NM dans le plasma humain pendant 1 h à 37 °C tout en mélangeant doucement à 500 tr/min dans un thermomixeur. Après l’incubation, centrifugez l’échantillon à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C pour granuler les MN.</li>
	<li>Recueillir le surnageant plasmatique pour l’analyse de la couronne des métabolites. Conserver le complexe corona de la protéine NM pour la caractérisation de la couronne protéique.</li>
</ol>4. Isolement de la couronne protéique
<ol><li>Resuspendez le complexe NM-protéine (la pastille) dans 1 mL de tampon PBS 10x et vortexez vigoureusement pendant 2 min pour éliminer les protéines non liées. Centrifuger la solution PBS à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C pour granuler les MN, et retirer soigneusement le surnageant sans perturber la pastille.</li>
	<li>Resuspendez la pastille dans 1 mL de tampon de bicarbonate d’ammonium (ABC) (100 mM, pH 8,0) et vortexez vigoureusement pendant 2 min pour éliminer les protéines non liées et les sels indésirables. Centrifuger à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C pour granuler les MN; retirer et jeter le surnageant. Répétez cette étape.</li>
	<li>Réduire les liaisons disulfure protéique en dissolvant la pastille de protéine NM dans 20 μL de tampon ABC (100 mM pH 8) contenant 10 mM de dithiothérapeute. Incuber la solution de réduction pendant 30 min à 56 °C.</li>
	<li>Pour digérer les protéines, ajouter 2 μg de trypsine de qualité séquençage à 20 μL d’ABC contenant 0,1% de tensioactif. Incuber la solution de digestion pendant 16 h à 37 °C.</li>
	<li>Alkyler l’échantillon par addition de 20 μL d’iodoacétamide à 55 mM dans 100 mM d’ABC et incuber à température ambiante pendant 20 min.</li>
	<li>Ajouter 20 μL de 0,1 M HCl pour cliver le tensioactif et laisser agir pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Enrichir et dessaler les peptides à l’aide d’une pointe de pipette de dessalement emballée en C18.<ol>
<li>Mouiller la pointe avec 80 μL 0,1% d’acide formique 50% acétonitrile 5 fois, nettoyer avec 80 μL 0,1% d’acide formique 5 fois, prélever et éluer l’échantillon 10 fois, dessaler l’échantillon en rinçant 80 μL 0,1% d’acide formique 5 fois et éluer l’échantillon 2 fois avec 80 μL 0,1% d’acide formique 70% acétonitrile dans un tube PCR propre à faible liaison.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lyophiliser les échantillons et les conserver à -20 °C jusqu’à analyse.</li>
</ol>5. Isolement de la couronne métabolite
<ol><li>Prenez le plasma témoin et le surnageant de l’incubation du plasma NM de l’étape 3.3 et conservez-le sur la glace pendant la préparation de l’échantillon.</li>
	<li>Prendre 50 μL de chacun dans des flacons séparés et diluer 1 sur 10 avec de l’eau DI. Prendre 50 μL de chaque échantillon dilué et passer à de nouveaux flacons pour l’étape 5.3.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de chloroforme, 250 μL de méthanol et 350 μL d’eau DI et mélanger vigoureusement le vortex pendant 2 min. Centrifuger pendant 10 min à 20 800 x g à 4 °C.</li>
	<li>Prélever 500 μL de surnageant et filtrer à travers un filtre centrifuge de 3 kDa pendant 2 h à 10 000 x g à 4 °C. Prendre 430 μL d’ultrafiltrat et sécher dans un aspirateur rapide. Les échantillons peuvent maintenant être congelés avant l’analyse.</li>
</ol>6. Préparation du système CESI-MS38
REMARQUE: Avant l’installation des capillaires, vérifiez que l’extrémité d’entrée et de sortie des capillaires est intacte et qu’il n’y a pas de bris visibles dans le capillaire.
<ol><li>Installation d’un capillaire à revêtement neutre pour l’analyse de la couronneprotéique 39.<ol>
<li>Placez un nouveau capillaire à revêtement neutre (90 cm de longueur avec un diamètre intérieur de 30 μm) dans l’instrument CESI en suivant les directives du fabricant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des capillaires CESI pour l’analyse protéomique.<ol>
<li>Rincer le capillaire de séparation dans la direction avant en utilisant 100 mM de HCl pendant 5 min à 100 psi et vérifier la formation de gouttelettes à la sortie du capillaire. Rincer les capillaires de séparation avec BGE à 100 psi pendant 10 min, puis DI de l’eau à 100 psi pendant 30 min (cela n’est nécessaire que pour les nouveaux capillaires).</li>
		<li>Rincer à la fois le capillaire de séparation et le capillaire conducteur avec du BGE à 90 psi pendant 5 min et assurer la formation de gouttelettes à l’extrémité de sortie des deux capillaires.</li>
		<li>Rincer le capillaire de séparation avec de l’eau DI à 90 psi pendant 10 min, puis 50 psi pendant 10 min avec 0,1 M HCl, suivi à nouveau de 90 psi pendant 10 min avec de l’eau DI et enfin BGE à 90 psi pendant 10 min. Couplez CESI à la SEP à l’aide d’une source de nanopulvérisation et d’un adaptateur comme décrit précédemment38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installation d’un capillaire de silice fondue nue pour la caractérisation de la couronne de métabolites38.<ol>
<li>Placez un nouveau capillaire de silice fondue nue (90 cm de longueur avec un diamètre interne de 30 μm) dans l’instrument CESI conformément aux directives du fabricant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des capillaires CESI pour l’analyse métabolomique.<ol>
<li>Rincer le capillaire de séparation dans la direction avant en utilisant 100% MeOH à 50 psi pendant 15 min et vérifier la formation de gouttelettes à la sortie du capillaire. Rincer à la fois le capillaire de séparation et le capillaire conducteur avec BGE à 90 psi pendant 5 min et assurer la formation de gouttelettes à la sortie des deux capillaires.</li>
		<li>Rincer le capillaire de séparation avec de l’eau DI à 90 psi pendant 10 min, puis 50 psi pendant 10 min avec 0,1 M NaOH, suivi à nouveau de 90 psi pendant 10 min avec de l’eau DI et enfin BGE à 90 psi pendant 10 min. Couplez CESI à l’ESI-MS à l’aide d’une source de nanopulvérisation et d’un adaptateur comme décrit précédemment. 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS pour l’analyse de la couronne protéique
<ol><li>Resuspendez les échantillons de l’étape 4.8 dans 20 μL d’acétate d’ammonium de 50 mM pH 4.0.</li>
	<li>Effectuer une injection hydrodynamique de 5 psi 10 s de l’échantillon. Séparer à l’aide d’une tension de séparation de 30 kV avec le gradient de pression suivant: 0-10 min à 1 psi, 10-35 min à 1,5 psi et 35-45 min à 5 psi en utilisant 100 mM, pH 2,9 acide acétique comme BGE.</li>
	<li>Collectez des spectres de masse compris entre 250 et 2000 m/z avec l’acquisition de fragmentation dépendante des données du top 10.</li>
	<li>Entre les échantillons, rincer capillaire avec 0,1 M HCl pendant 3 min à 100 psi et 10 min 100 psi de BGE pour la séparation capillaire et pendant 3 min à 100 psi pour le capillaire liquide conducteur.</li>
</ol>8. CESI-MS pour l’analyse de la couronne des métabolites
REMARQUE: Tous les échantillons doivent être analysés deux fois, une fois en mode positif pour la détection des cations et une fois en mode négatif pour la détection des anions. Les échantillons de plasma témoin doivent être analysés au moins 5 fois.
<ol><li>Resuspendez les échantillons de plasma exposés et non exposés au NM de l’étape 5.4 dans 430 μL d’eau DI et vortexez vigoureusement pendant 2 min. Filtrer à travers un filtre à membrane de 0,1 μm.</li>
	<li>Prendre 95 μL de filtrat et ajouter 5 μL d’étalons internes à 200 μM pour les cations (L-méthionine sulfone) et 400 μM pour les anions (acide 2,2,4,4-D4-citrique) et vortex vigoureusement. Centrifuger à 4 000 x g à 4 °C pendant 10 min avant l’analyse CESI-MS.</li>
	<li>Injecter l’échantillon hydrodynamiquement pendant 30 s (cations) et 40 s (anions) à 2 psi.</li>
	<li>Séparer les métabolites dans de l’acide acétique à 10% avec une tension de séparation de 30 kV en mode avant (cations) et inverse (anions). Le mode de séparation inverse est assisté par une pression avant de 0,5 psi sur le capillaire de séparation.</li>
	<li>Réglez le spectromètre de masse pour collecter des données en mode positif (cations) ou négatif (anions) sur la plage de masse 65-1000 m/z. Entre les échantillons, rincer les capillaires avec 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, DI eau et BGE à 50 psi pendant 2 min.</li>
</ol>

J.A.T est un employé d’AB Sciex UK Ltd qui participe en tant que partenaire industriel au projet ACEnano, J.A.T et tous les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts dans ce travail.

Il s’agit de la première méthode proposée pour caractériser la couronne biomoléculaire complète incorporant des protéines et des métabolites, à partir du même échantillon, en utilisant CESI-MS. La capacité de caractériser à la fois les protéines et les métabolites à partir du même échantillon augmentera considérablement la quantité de données recueillies à partir d’une seule exposition expérimentale permettant de mieux comprendre le processus de formation de la couronne et ses impacts sur la toxicité et l’efficacité des NM en tant que nanomédicaments. De plus, CESI-MS est une plate-forme idéale pour caractériser les deux classes de biomolécules avec juste un changement de capillaire requis. À l’avenir, de nouvelles méthodes développées pour l’EC non aqueux permettront d’effectuer la lipidomique à l’aide de CE-MS40, il est donc maintenant possible d’analyser les protéines, les métabolites et les lipides à l’aide d’une seule plate-forme. Les approches conventionnelles actuelles nécessiteraient deux plates-formes LC-MS dédiées, l’une pour la couronne protéique et l’autre pour la couronne métabolite. Ainsi, cette approche peut collecter deux fois plus de données à l’aide d’une seule plateforme analytique.
Il y a quelques mises en garde à cette approche en particulier avec le métabolite corona car ce protocole propose une mesure indirecte de la couronne. En tant que tel, le problème peut survenir lorsque les niveaux de métabolites sont présents à des concentrations élevées par rapport aux NM et que la baisse subséquente de la concentration de métabolites dans la matrice est faible. Cependant, contrairement à la couronne protéique, il est peu probable qu’une approche « taille unique » pour isoler la couronne métabolite soit développée en raison de chaque NM ayant des chimies de surface uniques. À l’avenir, il est plus probable que des approches spécifiques à la NM pour isoler la couronne métabolite seront développées et validées; cela ne s’appliquera qu’à ce NM spécifique. Malgré cela, le CESI-MS restera une plate-forme très appropriée pour la caractérisation des métabolites chargés polaires, quelle que soit la façon dont ils sont isolés. Il convient également de noter que si une pastille ne se forme pas pendant les étapes de centrifugation conçues pour granuler les NT, une force centrifuge plus élevée peut être nécessaire; cela est plus susceptible de se produire avec des NM moins denses. Il est également essentiel que toutes les étapes de filtrage soient respectées dans le protocole en raison de l’alésage étroit des capillaires, ceux-ci peuvent facilement être bloqués si des particules n’ont pas été éliminées de manière adéquate de l’échantillon.
Alors que la couronne protéique est un domaine de recherche intense depuis un certain nombre d’années, la capacité de combiner cela avec la couronne métabolite est un nouveau domaine d’intérêt pour les scientifiques qui étudient l’interface bio-nano6,14. À ce jour, la majorité de ces études se sont concentrées sur la fraction lipidique non polaire du métabolite corona9,28. Cette méthode actuelle permet la caractérisation des métabolites hautement polaires et chargés dans la couronne, qui comprend des métabolites importants impliqués dans le métabolisme énergétique, la glycolyse et la synthèse de l’ADN. En conséquence, lorsqu’il est combiné avec le flux de travail protéomique, une caractérisation plus holistique de la couronne biomoléculaire est possible. Cela permet une analyse plus approfondie des interactions bio-nano à l’avenir. Cette méthode permet d’améliorer les connaissances mécanistes sur l’endocytose médiée par les récepteurs via les interactions des protéines et des métabolites avec les récepteurs membranaires. En outre, les interactions inter et intra corona entre les protéines et les petites molécules peuvent être explorées; par exemple, il a été récemment démontré que les protéines de la couronne jouent un rôle clé dans le recrutement des métabolites15. Il convient de noter que les résultats représentatifs de la figure 3 et de la figure 4 sont la quantification absolue des métabolites, mais une approche non ciblée utilisant une analyse de données multivariées pour comparer toutes les caractéristiques de la CE-MS chez les témoins par rapport au plasma exposé permettrait également d’élucider la liaison aux métabolites. Ainsi, il existe une marge de manœuvre importante pour étudier comment, et lesquels, les métabolites et les protéines influencent leur recrutement respectif dans les couronnes NM. Ces études supplémentaires peuvent aider à concevoir des couronnes pour optimiser l’administration de nanomédicaments ou découvrir d’autres obstacles à leur développement, tels que la suppression de l’action pharmaceutique en raison du blocage biomoléculaire de la couronne ou des fonctionnalités de ciblage du masquage.
CESI-MS avec ses débits à l’échelle nanométrique d’environ 20 nL / min et l’utilisation minimale de solvants organiques offre une amélioration des références vertes et économiques par rapport aux normes LC-MS et nanoLC-MS en termes d’utilisation de solvants, les principaux défis pour les études métabolomiques et protéomiques, respectivement. CESI-MS offre des résultats hautement reproductibles pour le temps de migration et la zone de pointe qui se comparent favorablement aux méthodes basées sur LC-MS11,15. De plus, par rapport à nanoLC-MS, le report n’est pas un problème dans CESI-MS. Par conséquent, un nettoyage approfondi du système entre les analyses d’échantillons n’est pas nécessaire, ce qui améliore considérablement le débit d’échantillon11.
En résumé, le flux de travail proposé est le premier à détailler une approche pour caractériser à la fois les composants protéiques et métabolites de la couronne biomoléculaire complète des NM. Cela déverrouille un nouvel aspect des interactions bio-nano, la couronne métabolite, permettant ainsi la collecte de deux fois plus de données à partir du même échantillon, permettant une compréhension plus complète des interactions à l’interface bio-nano.

Les interactions bio-nano, à l’interface entre les surfaces des nanomatériaux (NM) et les matrices biologiques à partir desquelles les biomolécules s’adsorbent sur la NM, constituent un domaine de recherche intense qui sous-tend la nanosécurité et la nanomédecine1. Cette couche de biomolécules adsorbées confère une identité biologique aux NM, de sorte que les cellules les identifient comme « soi », influençant par la suite l’absorption, la distribution et les paramètres biologiques2,3,4. La grande majorité des études bio-nano se sont concentrées sur les protéines au sein de la couronne, et ont démontré que les protéines varient quantitativement et qualitativement entre les MT de compositions différentes5. Cette variation dépend à la fois des propriétés du NM telles que la taille, la fonctionnalisation et le matériau, en plus des propriétés de la matrice biologique, y compris la composition et la teneur en sel5. Un domaine d’intérêt croissant dans l’interface bio-nano sont les métabolites qui s’adsorbent en NMs6. Plusieurs études ont démontré que, comme pour les protéines, les propriétés NM sont un facteur clé dans la détermination de la composition des métabolites dans la couronne et qu’elles peuvent influencer les résultats biologiques de l’exposition nm6,7,8.
Dans les études de la couronne biomoléculaire, il existe quatre phases distinctes à sa caractérisation, la formation de la couronne, l’isolement des biomolécules au sein de la couronne, leur détection par spectrométrie de masse qualitative ou quantitative et l’identification9. À ce jour, une gamme de techniques ont été adoptées pour isoler la couronne protéique, y compris l’ébullition dans le tampon de fonctionnement SDS-PAGE, les extractions de solvants et de sel ou la digestion directe des protéines in situ à la surface des NM. En ce qui concerne les métabolites dans la couronne, l’isolement est plus complexe avec diverses méthodes utilisant des solvants ou même la dissolution des NM proposés comme solutions8,10,11. Cependant, contrairement à la couronne protéique, il est peu probable qu’une approche « taille unique » s’applique à l’isolement des métabolites des NM, en raison du large espace chimique occupé par le métabolome et de la diversité des NM possibles. Une autre approche consiste à caractériser la matrice biologique avant et après l’exposition aux NM avec la différence dans les concentrations de métabolites attribuée à l’adsorption des métabolites sur les NM.12
Cette approche alternative serait applicable à tous les biofluides et NM et bien qu’elle nécessite deux fois plus d’analyses, elle offre par conséquent une mesure beaucoup plus précise de la couronne métabolite et ne risque pas que de faibles récupérations de métabolites de la surface NM soient confondues avec une faible liaison du métabolite spécifique.
La deuxième étape de l’analyse de la couronne biomoléculaire est la détection des biomolécules. Traditionnellement pour les protéines de la couronne, cela a été la mission de nano-LC-MS, le cheval de bataille de la protéomique; d’autres approches telles queRMN 13,1D et 2D SDS-PAGE ont également été appliquées. En ce qui concerne le métabolite corona LC-MS7,GC-MS8 et la spectrométrie de masse par perfusion directe ont été utilisés14. Cependant, une nouvelle approche a récemment commencé à gagner du terrain, à savoir l’électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse (CE-MS)11,15 et a été présente dans les laboratoires NM en tant que technique autonome pour caractériser diverses propriétés physiques et chimiques des NM16. CE-MS est une technique de séparation orthogonale de nanoLC-MS et GC-MS et est capable de permettre la détection de métabolites hautement polaires et chargés17,18. De plus, le CE-MS est bien adapté à l’analyse des protéines et de leurs modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation et la glycosylation19,20,21,22. La dernière étape, l’identification et l’analyse des données peuvent être effectuées de plusieurs manières selon qu’une approche quantitative / qualitative ou ciblée / non ciblée est utilisée, ce qui ne relève toutefois pas du champ d’application de ce protocole.
CESI-MS, une combinaison de CE et d’une interface nanoESI, est une avancée récente dans la technologie CE utilisant une interface sans gaine. Cela permet la connexion directe de CE à très faible débit (<20 nL / min) à un spectromètre de masse à haute résolution sans dilution, ce qui améliore considérablement la sensibilité de détection23,24,25. CESI-MS permet d’analyser des échantillons à volume limité (< 10 μL) tout en maintenant une analyse très sensible26. CESI-MS se compare également favorablement aux approches nanoLC-MS traditionnelles à faible débit utilisées en protéomique et en métabolomique en termes de reproductibilité27,28, débit et de report, ce qui en fait une perspective passionnante pour la caractérisation complète de la couronne biomoléculaire.
Pour mettre en évidence le potentiel de CESI-MS pour l’analyse des interactions bio-nano, ce travail décrit la préparation de l’échantillon nécessaire pour isoler la couronne biomoléculaire NM d’un seul échantillon de plasma humain de manière à maximiser les données des aspects protéiques et métabolites de la couronne NM biomoléculaire complète. Bien que nous rendions compte de l’utilisation du plasma humain, ce protocole serait tout aussi approprié pour d’autres biofluides tels que le sérum sanguin, le milieu de culture cellulaire complet, le lysate cellulaire, le liquide céphalorachidien ou l’urine. Les analyses de ces deux composants (protéines et métabolites) seront ensuite décrites à l’aide de capillaires CESI à revêtement neutre pour la couronne protéique et de capillaires de silice fondue nue pour les métabolites cationiques et anioniques.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,4,4-D4-citric</td>
			<td>Simga</td>
			<td>485438-1G</td>
			<td>Internal standard anion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge coolant</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>359976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 instrument</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>A98089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Cap</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B24699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Vials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650498</td>
			<td>Toxic, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 1mol/L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iosoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine sulfone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0876-1G</td>
			<td>Internal standard cation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14262</td>
			<td>Use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoVials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5043467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Surface Cartridge 30 &#181;M ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07363</td>
			<td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &#181;m ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahte buffered saline 10x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips, 100 &#181;L bed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>16688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>08226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapigest SF (surfactant)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiO2 Ludox TM-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>420786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide solution</td>
			<td>Simga</td>
			<td>72079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 Dispex coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 PVP coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 uncoated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

L’adsorption de biomolécules des matrices biologiques environnantes à la surface des nanomatériaux (NM) pour former la couronne présente un intérêt depuis une dizaine d’années. L’intérêt pour l’interface bio-nano provient du fait que la couronne biomoléculaire confère une identité biologique aux ND et amène ainsi le corps à les identifier comme « soi ». Par exemple, des études antérieures ont démontré que les protéines de la couronne sont capables d’interagir avec les récepteurs membranaires pour influencer l’absorption cellulaire et ont établi que la couronne est responsable du trafic cellulaire des NM et de leur toxicité éventuelle. À ce jour, la plupart des recherches se sont concentrées sur la couronne protéique et ont négligé les impacts possibles des métabolites inclus dans la couronne ou les effets synergiques entre les composants de la couronne biomoléculaire complète. En tant que tel, ce travail démontre des méthodologies pour caractériser à la fois les composants protéiques et métabolites de la couronne biomoléculaire en utilisant des approches protéomiques et métabolomiques ascendantes en parallèle. Cela comprend une digestion sur particule de la couronne protéique avec un tensioactif utilisé pour augmenter la récupération des protéines, et une caractérisation passive de la couronne métabolite en analysant les matrices des métabolites avant et après les expositions NM. Ce travail introduit l’électrophorèse capillaire – spectrométrie de masse (CESI-MS) comme nouvelle technique pour la caractérisation des couronnes NM. Les protocoles décrits ici démontrent comment cesI-MS peut être utilisé pour la caractérisation fiable de la couronne protéique et métabolite acquise par les NM. Le passage au CESI-MS réduit considérablement le volume d’échantillon requis (par rapport aux approches traditionnelles de chromatographie liquide – spectrométrie de masse (LC-MS)) avec des injections multiples possibles à partir d’aussi peu que 5 μL d’échantillon, ce qui le rend idéal pour les échantillons à volume limité. En outre, les conséquences environnementales de l’analyse sont réduites en ce qui concerne la LC-MS en raison des faibles débits (<20 nL/min) dans cesi-MS et de l’utilisation d’électrolytes aqueux qui éliminent le besoin de solvants organiques.

La méthode décrite est la première à caractériser à la fois les protéines et les métabolites de la couronne biomoléculaire NM en utilisant le même échantillon de plasma humain. Cette méthode est capable de détecter >200 protéines et >150 métabolites, permettant ainsi de déterminer la vue d’ensemble la plus complète de la couronne biomoléculaire complète, ce qui permet une meilleure compréhension de l’attachement, de l’absorption et des impacts cellulaires des NT.
L’utilisation de CESI-MS pour la séparation et la détection de la protéomique (Figure 1) et de la métabolomique (Figure 2) montre de bonnes fenêtres de séparation sur les deux capillaires pour chaque approche.
Cette méthode est capable de distinguer les protéines de la couronne à travers un large éventail de compositions de NMs, démontrant ainsi l’applicabilité des méthodes aux NM à travers un large éventail de caractéristiques physiques et chimiques (Tableau 1).
Les empreintes digitales uniques de la couronne métabolite peuvent également être distinguées à l’aide de la branche métabolomique de cette méthodologie (Figure 3). Bien que cette approche utilise une approche passive pour caractériser la couronne du métabolite NM, elle est toujours capable de découvrir des informations intéressantes sur le rôle des métabolites dans la couronne biomoléculaire, telles que l’adsorption différentielle des isomères(Figure 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Figure 1 : Exemple d’électrophérogramme d’une séparation corona de la protéineSiO2 à l’aide de CESI-MS après une digestion sur particules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Figure 2 : Exemple d’électrophérogrammes ioniques extraits obtenus à partir de composés endogènes dans le plasma par CE-MS. Les composés numérotés sont les suivants: 1. Ornithine; 2. Lysine; 3. Arginine; 4. Histidine; 5. Créatine; 6. Glycine; 7. Alanine; 8. Valine; 9. Isoleucine; 10. Leucine; 11. Sérine; 12. Thréonine; 13. Asparagine; 14. Méthionine; 15. Glutamine; 16. Acide glutamique; 17. Phényl-D5-alanine; 18. Phénylalanine; 19. Tyrosine; 20. Proline; 21. Méthionine sulfone (étalon interne). Publié sous une licence Creative Commons CC BY en libre accès et reproduit à partir de Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Analyse de la couronne protéique sur un réseau de 6 NM. Carte thermique des classes de protéines identifiées sur la silice(SiO2),le titane (TiO2), le titane coiffé de PVP (TiO2-PVP), le titane coiffé de dispex (TiO2-Dispex), le polystyrène et le polystyrène carbylé NM. Les pourcentages se réfèrent à l’abondance des protéines par rapport à la teneur totale en protéines en fonction de l’abondance des 3 principaux peptides pour chaque protéine. Compte tenu des différences observées dans les abondances relatives de protéines dans les différentes couronnes NM, il est clair que ce protocole proposé est suffisamment sensible pour différencier la couronne protéique de différents NM. Figure reproduite à partir d’une analyse CESI-MS de la couronne protéique, publiée sous une licence Creative Commons CC BY en libre accès11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Figure 3 : Analyse ciblée des métabolites cationiques dans la couronne NM. Adsorption des cations enSiO2 etTiO2 NMs. Le rouge fait référence à la concentration initiale de métabolites tandis que le bleu fait référence à la concentration de métabolites après une incubation de 1 h avec les NM à 37 °C. La réduction de la concentration de métabolites dans la solution est le résultat de l’adsorption de métabolites à la surface du NM. Aucune adsorption significative des métabolites n’a été observée pour les NM de polystyrène. Les diagrammes de boîte représentent les valeurs minimales et maximales, les plages médiane et interquartile. Figure reproduite à partir d’une analyse ciblée CESI-MS du métabolite corona publiée sous une licence Creative Commons CC BY en libre accès15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Figure 4 : Analyse ciblée des métabolites anioniques dans la couronne NM en mettant l’accent sur l’adsorption des isomères. L’adsorption des anions sur une gamme de NM de titane montre des différences claires entre divers isomères tels que les phosphates de sucre. Le rouge fait référence à la concentration initiale de métabolites tandis que le bleu fait référence à la concentration de métabolites après une incubation de 1 h avec le NM à 37 °C. La réduction de la concentration de métabolites en solution est le résultat de l’adsorption des métabolites à la surface du NM. Aucune adsorption significative des métabolites n’a été observée pour leSiO2 et le polystyrène NMs. Les diagrammes de boîte représentent les valeurs minimales et maximales, les plages médiane et interquartile. Figure reproduite à partir d’une analyse ciblée CESI-MS du métabolite corona publiée sous une licence Creative Common CC BY en libre accès15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analyte</td>
			<td>Zone de crête RSD moyenne</td>
			<td>Temps moyen de migration RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 peptides intraday (n= 3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cations intra-journaliers (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cations inter-jours (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Reproductibilité des répliques techniques cesi-MS pour les peptides et les métabolites cationiques. DSR : écart-type relatif, comme mesure de la reproductibilité. La reproductibilité du CESI-MS en termes de zones de pointe et de temps de migration est très bonne, tous les analytes ayant une DSR moyenne <15% et des temps de migration <2,2%. Ces résultats démontrent le haut degré de confiance qui peut être attribué aux données recueillies à l’aide de cette technique et confirment que les variations détectées sont dues à de réelles différences dans la composition de l’échantillon (enrichissement en NT) plutôt qu’à des variations analytiques. Le tableau 2 est généré à partir des résultats présentés précédemment11,15.

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Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Nous présentons ici un protocole pour caractériser la couronne biomoléculaire complète, les protéines et les métabolites, acquis par les nanomatériaux à partir de biofluides en utilisant une approche d’électrophorèse capillaire – spectrométrie de masse.

Approches de spectrométrie de masse par électrophorèse capillaire pour la caractérisation de la protéine et du métabolite Corona acquis par les nanomatériaux

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-approaches-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

4.2K vues.  University of Birmingham. Nous présentons ici un protocole pour caractériser la couronne biomoléculaire complète, les protéines et les métabolites, acquis par les nanomatériaux à partir de biofluides en utilisant une approche d’électrophorèse capillaire – spectrométrie de masse.

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Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

Analyser la dynamique des protéines en utilisant l&#39;hydrogène change spectrométrie de masse

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Recherche

Chimie

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Spectrométrie de masse approches pour étudier la structure des protéines et interactions dans lyophilisées Poudres

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Utilisation de l&#39;électrophorèse capillaire à Quantifier acides organiques à partir de tissus végétaux: Un cas de test d&#39;examen<em&gt; Coffea Arabica</em&gt; Graines

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Un dosage de HS-MRM pour la Quantification des protéines de la cellule-hôte en protéine Biopharmaceuticals par chromatographie en phase liquide Ion Mobility QTOF spectrométrie de masse

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Analyse de l’haleine en temps réel en utilisant l’ionisation secondaire SPECTROMETRIE couplée à la spectrométrie de masse haute résolution

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Synthèse et analyse de spectrométrie de masse des Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Microsonde électrophorèse capillaire spectrométrie de masse pour la métabolomique unicellulaires dans les embryons de grenouilles vivent (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Analyse des Architectures de protéine et Complexes protéine-Ligand par spectrométrie de masse structurelle intégrative

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Protéomique de haut vers le bas à grande échelle à l’aide de l’électrophorèse de Zone capillaire Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Surveillance des médicaments haut débit et complet à l’aide de la spectrométrie de masse de l’électrophorèse capillaire-Injection Multisegment

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...