A.J.C, J.A.T e I.L reconhecem o financiamento da Comissão Europeia via Horizon 2020 projeto ACEnano (Grant no. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z reconhece o financiamento de doutorado do Conselho de Bolsas da China (CSC, No. 201507060011). R.R reconhece o apoio financeiro do regime de subvenção vidi da Organização Holandesa de Pesquisa Científica (NWO Vidi 723.0160330).

O uso de biofluido humano foi aprovado de acordo com as diretrizes do protocolo IRB da Universidade de Leiden e da Universidade Médica de Innsbruck. Quando os biofluidos humanos ou animais estão sendo investigados, é necessária a aprovação ética da instituição de pesquisa, e foi obtida no caso dos resultados mostrados neste protocolo. Além disso, também devem ser realizados relatórios adequados para garantir transparência e reutilização dos dados no trabalho futuro9,29,30.
1. Preparação de eletrólitos de fundo (BGE)
NOTA: Todos os solventes devem ser preparados em um capô de fumaça adequado e equipamentos de proteção individual adequados devem ser usados para todas as etapas (casaco de laboratório, luvas e óculos). Em cada etapa, frascos plásticos de baixa ligação são necessários para minimizar a perda de analitos e a contaminação da amostra com sais lixiviados de vidro.
<ol><li>Prepare 10% de ácido acético BGE (v/v), pH 2.2 diariamente para metabolômica.<ol>
<li>Em um frasco volumoso de 10 mL adicione 1 mL de ácido acético, seguido pela adição de água deionizada (DI) à linha marcada e mistura completa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare ácido acético de 100 mM, pH 2.9 diariamente para proteômica.<ol>
<li>Em um frasco volumoso de 10 mL adicione 57 μL de ácido acético, seguido pela adição de água DI à linha marcada e mistura completa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação nm
<ol><li>Disperse vigorosamente as NMs na água utilizando as diretrizes publicadas31,32,33. NOTA: No desenvolvimento deste protocolo, foram utilizados 7 NMs da seguinte forma: foram utilizados 100 e 1.000 nm de poliestireno carboxilado para proteína e corona metabólito, respectivamente. NMs de poliestireno não modificado de 100 nm, 13 nm anatase TiO2 NMs que não foram modificados ou revestidos com polímeros poliacrilatos ou PVP e 22NMs não modificados foram utilizados para coroas de proteína e metabólito. Embora o método tenha sido desenvolvido e demonstrado usando esses NMs, deve-se notar que essa abordagem seria aplicável para uma ampla gama de composições, tamanhos, formas e morfologias de NM.</li>
	<li>Caracterize o tamanho das partículas usando a dispersão de luz dinâmica34,35, uma única partícula acoplada indutivamente espectrometria de massa plasmática36,análise de rastreamento de nanopartículas37, ou microscopia eletrônica de transmissão e carga superficial como potencial zeta usando um tamanho de zeta34.</li>
</ol>3. Formação de corona biomolecular
<ol><li>Divida 2 mL de plasma humano (ou biofluido de escolha) em alíquotas de 1 mL, uma para o metabólito e corona de proteína e a segunda para caracterização metabolome plasmática.</li>
	<li>Incubar 1 mg/mL de NMs no plasma humano por 1 h a 37 °C enquanto mistura suavemente a 500 rpm em um termomixer. Após a incubação centrífuga a amostra a 4.000 x g por 15 min a 4 °C para pelotar os NMs.</li>
	<li>Colete o supernatante de plasma para análise de corona metabólito. Reter o complexo corona-proteína-NM para caracterização de proteína corona.</li>
</ol>4. Isolamento da coroa proteica
<ol><li>Resuspend o complexo de proteína NM (a pelota) em 1 mL de 10x PBS Buffer e vórtice vigorosamente por 2 min para remover proteínas desvinculadas. Centrifugar a solução PBS a 4.000 x g por 15 min a 4 °C para pelotar os NMs, e remover cuidadosamente o supernatante sem perturbar a pelota.</li>
	<li>Resuspenque a pelota em 1 mL de tampão de bicarbonato de amônio (ABC) (100 mM, pH 8.0) e vórtice vigorosamente por 2 min para remover proteínas desvinculadas e sais indesejados. Centrifugar a 4.000 x g por 15 min a 4 °C para pelotar os NMs; remover e descartar o supernante. Repita este passo.</li>
	<li>Reduzir as ligações de dissulfeto proteico dissolvendo a pelota de proteína NM em 20 μL de tampão ABC (100 mM pH 8) contendo dithiotheritol de 10 mM. Incubar a solução de redução por 30 min a 56 °C.</li>
	<li>Para digerir proteínas, adicione 2 μg de trippsina de grau de sequenciamento a 20 μL de ABC contendo 0,1% de surfactante. Incubar a solução de digestão por 16 h a 37 °C.</li>
	<li>Alquilar a amostra pela adição de 20 μL de iodoacetamida a 55 mM em 100 mM ABC e incubar à temperatura ambiente por 20 min.</li>
	<li>Adicione 20 μL de 0,1 M HCl para cortar o surfactante e deixe por 10 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Enriquecer e desaltar peptídeos usando uma ponta de pipeta desalada embalada C18.<ol>
<li>Molhe a ponta com 80 μL 0,1% de ácido fórmico 50% acetonitrilo 5 vezes, limpo com 80 μL 0,1% de ácido fórmico 5 vezes, elaborar e elute amostra 10 vezes, desaltar amostra de 80 μL 0,1 % ácido fórmico 5 vezes e eluto a amostra 2 vezes com 80 μL 0,1% ácido formômico 70% acetonitrilo em um tubo PCR de baixa ligação limpa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lyophilize as amostras e armazene a -20 °C até a análise.</li>
</ol>5. Isolamento da coroa metabólito
<ol><li>Pegue o plasma de controle e o supernasal da incubação de plasma NM a partir do Passo 3.3 e mantenha no gelo durante a preparação da amostra.</li>
	<li>Pegue 50 μL de cada um em frascos separados e dilua 1 em 10 com água DI. Pegue 50 μL de cada amostra diluída e passe para novos frascos para a etapa 5.3.</li>
	<li>Adicione 200 clorofórmio μL, 250 μL de metanol e 350 μL de água DI e vigorosamente mistura de vórtice por 2 min. Centrifugar por 10 min a 20.800 x g a 4 °C.</li>
	<li>Pegue 500 μL de supernadante e filtre através de um filtro centrífugo de 3 kDa por 2 h a 10.000 x g a 4 °C. Tome 430 μL de ultrafiltrato e seque em uma vac de velocidade. As amostras já podem ser congeladas antes da análise.</li>
</ol>6. Preparação do sistema CESI-MS38
NOTA: Antes da instalação dos capilares, verifique se a entrada e a extremidade de saída dos capilares estão intactas e se não há quebras visíveis no capilar.
<ol><li>Instalação de capilar revestido neutro para análise de proteína corona39.<ol>
<li>Coloque um novo capilar revestido neutro (90 cm de comprimento com 30 μm de diâmetro interno) no instrumento CESI seguindo as diretrizes do fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de capilares CESI para análise proteômica.<ol>
<li>Lave o capilar de separação na direção dianteira usando 100 mM de HCl por 5 min a 100 psi e verifique se há formação de gotícula na saída do capilar. Capilar de separação de flush com BGE a 100 psi por 10 min e depois dI água a 100 psi por 30 min (isso só é necessário para novos capilares).</li>
		<li>Lave tanto o capilar de separação quanto o capilar condutivo com BGE a 90 psi por 5 min e certifique-se de forma de gotículas na extremidade de saída de ambos os capilares.</li>
		<li>Lave o capilar de separação com água DI a 90 psi por 10 minutos, depois 50 psi por 10 min com 0,1 M HCl, seguido novamente por 90 psi por 10 min com água DI e finalmente BGE a 90 psi por 10 min. Casal CESI para o MS usando uma fonte de nanospray e adaptador como descrito anteriormente38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Instalação de capilar de sílica fundido nu para caracterização de coroa metabólito38.<ol>
<li>Coloque um novo capilar de sílica fundido nu (90 cm de comprimento com um diâmetro interno de 30 μm) no instrumento CESI seguindo as diretrizes do fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de capilares CESI para análise metabolômica.<ol>
<li>Lave o capilar de separação na direção dianteira usando 100% MeOH a 50 psi por 15 min e verifique se há formação de gotícula na saída do capilar. Lave tanto o capilar de separação quanto o capilar condutivo com BGE a 90 psi por 5 min e as gotas se formam na saída de ambos os capilares.</li>
		<li>Lave o capilar de separação com água DI a 90 psi por 10 minutos, depois 50 psi por 10 min com 0,1 M NaOH, seguido novamente por 90 psi por 10 min com água DI e finalmente BGE a 90 psi por 10 min. Casal CESI para o ESI-MS usando uma fonte de nanospray e adaptador como descrito anteriormente. 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS para análise de corona de proteína
<ol><li>Resuspend amostras da etapa 4.8 em 20 μL de 50 mM de acetato de amônio pH 4.0.</li>
	<li>Realize 5 psi 10 s injeção hidrodinâmica de amostra. Separe usando uma tensão de separação de 30 kV com o seguinte gradiente de pressão: 0-10 min a 1 psi, 10-35 min a 1,5 psi e 35-45 min a 5 psi usando 100 mM, pH 2,9 ácido acético como BGE.</li>
	<li>Colete espectros de massa entre 250-2000 m/z com aquisição de fragmentação dependente de dados top-10.</li>
	<li>Entre as amostras, enxágue capilar com 0,1 M HCl por 3 min a 100 psi e 10 min 100 psi de BGE para separação capilar e por 3 min a 100 psi para o capilar líquido condutor.</li>
</ol>8. CESI-MS para análise de corona metabólito
NOTA: Todas as amostras devem ser analisadas duas vezes, uma no modo positivo para a detecção de cáções e uma vez no modo negativo para a detecção de ânions. As amostras de plasma de controle precisam ser analisadas pelo menos 5 vezes.
<ol><li>Resuspend NM amostras de plasma expostas e não expostas da etapa 5.4 em 430 μL de água DI e vigorosamente vórtice por 2 min. Filtrar através de um filtro de membrana de 0,1 μm.</li>
	<li>Pegue 95 μL de filtrado e adicione 5 μL de padrões internos a 200 μM para cáations (L-methionine sulfone) e 400 μM para ânions (2,2,4,4,4-D4-ácido cítrico) e vórtice vigorosamente. Centrifuuga a 4.000 x g a 4 °C por 10 minutos antes da análise CESI-MS.</li>
	<li>Injete amostra hidrodinamicamente para 30 s (cáations) e 40 s (ânions) a 2 psi.</li>
	<li>Separe metabólitos em ácido acético de 10% com uma tensão de separação de 30 kV no modo para a frente (cáations) e reverso (ânions). O modo de separação reversa é auxiliado com pressão de 0,5 psi para a frente no capilar de separação.</li>
	<li>Defina espectrômetro de massa para coletar dados no modo positivo (caations) ou negativo (ânions) ao longo da faixa de massa de 65-1000 m/z. Entre as amostras, enxágue capilar com 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, dI água e BGE a 50 psi por 2 min.</li>
</ol>

J.A.T é um funcionário da AB Sciex UK Ltd que está participando como um parceiro do setor no projeto ACEnano, J.A.T e todos os outros autores não têm conflito de interesse neste trabalho.

Este é o primeiro método proposto para caracterizar a coroa biomolecular completa incorporando proteínas e metabólitos, a partir da mesma amostra, utilizando CESI-MS. A capacidade de caracterizar tanto as proteínas quanto os metabólitos da mesma amostra aumentará significativamente a quantidade de dados coletados de uma única exposição experimental, permitindo novas percepções sobre o processo de formação de corona e seus impactos para as NMs toxicidade e eficácia como nanomedicinas. Além disso, o CESI-MS é uma plataforma ideal para caracterizar ambas as classes de biomoléculas com apenas uma mudança de capilar necessária. Seguindo em frente, novos métodos desenvolvidos para CE não aquoso permitirão que a lipidômica seja realizada usando o CE-MS40, portanto, agora é possível analisar proteínas, metabólitos e lipídios usando uma única plataforma. As abordagens convencionais atuais exigiriam duas plataformas dedicadas de LC-MS, uma para a corona de proteína e outra para a corona metabólito. Assim, essa abordagem pode coletar o dobro de dados usando uma única plataforma analítica.
Há algumas ressalvas a esta abordagem particularmente com a coroa metabólica, pois este protocolo propõe uma medição indireta da coroa. Como tal, o problema pode surgir quando os níveis de metabólito estão presentes em altas concentrações em relação aos NMs e a subsequente queda na concentração de metabólitos na matriz é pequena. No entanto, ao contrário da corona proteica, é improvável que uma abordagem "de um tamanho se encaixe em todos" para isolar a coroa metabólito será desenvolvida devido a cada NM ter químicas superficiais únicas. Daqui para frente, é mais provável que abordagens específicas de NM para isolar a coroa metabólica sejam desenvolvidas e validadas no entanto; isso será aplicável apenas a essa NM específica. Apesar disso, o CESI-MS ainda será uma plataforma altamente adequada para a caracterização dos metabólitos carregados polares, independentemente de como eles estão isolados. Também é notável que se uma pelota não se formar durante as etapas de centrifugação projetadas para pelotar os NMs, uma força centrífuga mais alta pode ser necessária; isso é mais provável de ocorrer com NMs menos densas. Também é fundamental que todas as etapas de filtragem sejam cumpridas dentro do protocolo devido ao furo estreito dos capilares que estes podem facilmente ser bloqueados se qualquer material particulado não tiver sido adequadamente eliminado da amostra.
Embora a proteína corona tenha sido uma área intensa de pesquisa por vários anos, a capacidade de combinar isso com a coroa metabólito é um novo campo de interesse para os cientistas que investigam a interface bio-nano6,14. Até o momento, a maioria desses estudos se concentrou na fração lipídica não polar da corona metabólito9,28. Este método atual permite a caracterização dos metabólitos altamente polares e carregados na coroa, que inclui metabólitos importantes envolvidos no metabolismo energético, glicolise e síntese de DNA. Como resultado, quando combinado com o fluxo de trabalho proteômico, é possível uma caracterização mais holística da coroa biomolecular. Isso permite uma análise mais aprofundada das interações bio-nano avançando. Este método permite insights mecanicistas aprimorados sobre a endocitose mediada por receptores através de interações proteicas e metabólicas com receptores de membrana. Além disso, podem ser exploradas interações inter e intra corona entre proteínas e pequenas moléculas; por exemplo, foi recentemente demonstrado que as proteínas na coroa desempenham um papel fundamental no recrutamento de metabólitos15. Vale ressaltar que os resultados representativos na Figura 3 e Figura 4 são quantificação absoluta de metabólitos, no entanto, uma abordagem não alvo usando análise de dados multivariados para comparar todas as características ce-ms em controles em comparação com plasma exposto também elucidaria a ligação metabolita. Assim, há um escopo significativo para investigar como, e quais, metabólitos e proteínas influenciam seu respectivo recrutamento em coroas NM. Esses estudos adicionais podem ajudar a projetar coronas para otimizar a entrega de nanomedicinas ou descobrir mais obstáculos ao seu desenvolvimento, como a supressão da ação farmacêutica devido ao bloqueio biomolecular da coroa ou mascarando funcionalidades de alvo.
O CESI-MS com suas taxas de fluxo em escala nano de cerca de 20 nL/min e uso mínimo de solventes orgânicos oferece uma melhoria nas credenciais verdes e econômicas em relação ao padrão LC-MS e nanoLC-MS em termos de uso de solventes, os principais desafios para estudos de metabolômica e proteômica, respectivamente. O CESI-MS oferece resultados altamente reprodutíveis tanto para o tempo de migração quanto para a área de pico, que se comparam favoravelmente com os métodos baseados em LC-MS11,15. Além disso, em comparação com o nanoLC-MS, o carry-over não é um problema no CESI-MS. Portanto, não é necessária uma limpeza extensiva do sistema entre as análises amostrais, o que melhora muito o rendimento da amostra11.
Em resumo, o fluxo de trabalho proposto é o primeiro a detalhar uma abordagem para caracterizar tanto os componentes proteicos quanto metabólicos da coroa biomolecular completa de NMs. Isso desbloqueia um novo aspecto das interações bio-nano, a corona metabolita, permitindo assim a coleta de duas vezes mais dados da mesma amostra, permitindo uma compreensão mais completa das interações na interface bio-nano.

Interações bio-nano, na interface entre superfícies nanomateriais (NM) e matrizes biológicas das quais biomoléculas adsorb para o NM, é uma área intensa de pesquisa que sustenta a nanossegurança e nanomedicina1. Essa camada de biomoléculas adsorvidas confere uma identidade biológica às NMs, assim as células as identificam como "eu", influenciando posteriormente a absorção celular, distribuição e pontos finais biológicos2,3,4. A grande maioria dos estudos bio-nano se concentrou nas proteínas dentro da coroa, e demonstrou que as proteínas variam quantitativamente e qualitativamente entre NMs de diferentes composições5. Essa variação depende tanto das propriedades do NM como tamanho, funcionalização e material, além das propriedades da matriz biológica, incluindo composição e teor de sal5. Uma área crescente de interesse na interface bio-nano são os metabólitos que adsorb para NMs6. Vários estudos têm demonstrado que, assim como as proteínas, as propriedades de NM são um fator-chave na determinação da composição dos metabólitos na coroa e que podem influenciar os desfechos biológicos da exposição de NM6,7,8.
Em estudos da corona biomolecular há quatro fases distintas à sua caracterização, formação de corona, isolamento das biomoléculas dentro da coroa, sua detecção via espectrometria de massa qualitativa ou quantitativa e identificação9. Até o momento, uma série de técnicas foram adotadas para isolar a coroa proteica, incluindo a ebulição em tampão de execução SDS-PAGE, extrações de solventes e sal ou digestão direta de proteínas in situ na superfície de NMs. Em termos dos metabólitos na coroa, o isolamento é mais complexo com vários métodos utilizando solventes ou mesmo a dissolução das NMs propostas como soluções8,10,11. No entanto, ao contrário da proteína corona uma abordagem "um tamanho se encaixa em todos" é improvável de aplicar-se ao isolamento de metabólitos de NMs, devido ao amplo espaço químico ocupado pelo metabolome e a diversidade de possíveis NMs. Uma abordagem alternativa é caracterizar a matriz biológica antes e depois da exposição de NM com a diferença nas concentrações metabólicas atribuídas à adsorção de metabólitos às NMs.12
Esta abordagem alternativa seria aplicável a todos os biofluidos e NMs e, embora exija o dobro da análise, ela consequentemente oferece uma medida muito mais precisa da coroa metabólito e não tem risco de baixa recuperação metabólica da superfície NM ser confundida com baixa ligação do metabólito específico.
O segundo passo para a análise biomolecular da coroa é a detecção das biomoléculas. Tradicionalmente para as proteínas na coroa, este tem sido o mandato de nano-LC-MS, o cavalo de trabalho da proteômica; outras abordagens como NMR13, 1D e 2D SDS-PAGE também foram aplicadas. Em termos de corona metabólica LC-MS7,GC-MS8 e espectrometria de massa de infusão direta foram utilizadas14. No entanto, uma nova abordagem começou recentemente a ganhar tração, ou seja, a espectrometria de massa capilar (CE-MS)11,15 e tem estado presente nos laboratórios de NM como uma técnica autônoma para caracterizar várias propriedades físicas e químicas das NMs16. CE-MS é uma técnica de separação ortogonal para nanoLC-MS e GC-MS e é capaz de permitir a detecção de metabólitos altamente polares e carregados17,18. Além disso, a CE-MS é adequada para a análise de proteínas e suas modificações pós-transacionais, como fosforilação e glicosilação19,20,21,22. A etapa final, identificação e análise de dados podem ser realizadas de várias formas, dependendo se uma abordagem quantitativa/qualitativa ou direcionada/não direcionada está sendo utilizada, isso, no entanto, está fora do mandato deste protocolo.
CESI-MS, uma combinação de CE e uma interface nanoESI, é um avanço recente na tecnologia CE utilizando uma interface sem baia. Isso permite a conexão direta do fluxo ultra-baixo CE (<20 nL/min) a um espectrômetro de massa de alta resolução sem diluição, resultando em sensibilidade de detecção significativamente melhorada23,24,25. O CESI-MS permite que amostras limitadas de volume (< 10 μL) sejam analisadas mantendo uma análise altamente sensível26. O CESI-MS também se compara favoravelmente às abordagens tradicionais de nanoLC-MS de baixa taxa de fluxo utilizadas em proteômica e metabolômica em termos de reprodutibilidade27,28, throughput, e carry over tornando-se uma perspectiva emocionante para a caracterização completa da coroa biomolecular.
Para destacar o potencial do CESI-MS para as análises das interações bio-nano este trabalho descreve a preparação da amostra necessária para isolar a coroa biomolecular NM de uma única amostra de plasma humano de forma a maximizar os dados dos aspectos proteicos e metabólicos da coroa biomolecular completa nmolcular. Enquanto reportamos sobre o uso de plasma humano, este protocolo seria igualmente apropriado para outros biofluidos, como soro sanguíneo, meio de cultura celular completa, liseto celular, fluido cefalorraquidiano ou urina. As análises desses dois componentes (proteínas e metabólitos) serão então descritas usando capilares CESI revestidos neutros para a coroa de proteína e capilares de sílica fundidos nus para metabólitos cationicos e aniônicos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,4,4-D4-citric</td>
			<td>Simga</td>
			<td>485438-1G</td>
			<td>Internal standard anion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge coolant</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>359976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 instrument</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>A98089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Cap</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B24699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Vials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650498</td>
			<td>Toxic, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 1mol/L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iosoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine sulfone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0876-1G</td>
			<td>Internal standard cation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14262</td>
			<td>Use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoVials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5043467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Surface Cartridge 30 &#181;M ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07363</td>
			<td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &#181;m ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahte buffered saline 10x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips, 100 &#181;L bed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>16688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>08226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapigest SF (surfactant)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiO2 Ludox TM-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>420786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide solution</td>
			<td>Simga</td>
			<td>72079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 Dispex coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 PVP coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 uncoated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

A adsorção de biomoléculas de matrizes biológicas circundantes à superfície de nanomateriais (NMs) para formar a coroa tem sido de interesse na última década. O interesse pela interface bio-nano decorre do fato de que a corona biomolecular confere uma identidade biológica aos NMs e, portanto, faz com que o corpo os identifique como "eu". Por exemplo, estudos anteriores demonstraram que as proteínas na coroa são capazes de interagir com receptores de membrana para influenciar a captação celular e estabeleceram que a coroa é responsável pelo tráfico celular de NMs e sua eventual toxicidade. Até o momento, a maioria das pesquisas se concentrou na corona proteica e ignorou os possíveis impactos dos metabólitos incluídos na coroa ou efeitos sinérgicos entre componentes na coroa biomolecular completa. Como tal, este trabalho demonstra metodologias para caracterizar tanto os componentes proteicos quanto metabólicos da coroa biomolecular utilizando abordagens proteômicas e metabolômicas de baixo para cima em paralelo. Isso inclui um digestão sobre partículas da corona proteica com um surfactante usado para aumentar a recuperação de proteínas, e uma caracterização passiva da coroa metabólito analisando matrizes metabólicas antes e depois das exposições de NM. Este trabalho introduz a eletroforese capilar – espectrometria de massa (CESI-MS) como uma nova técnica para caracterização de coroa NM. Os protocolos aqui descritos demonstram como o CESI-MS pode ser usado para a caracterização confiável tanto da proteína quanto da corona metabólito adquirida pelas NMs. A mudança para CESI-MS diminui consideravelmente o volume de amostra necessária (em comparação com a cromatografia líquida tradicional – espectrometria de massa (LC-MS) se aproxima) com múltiplas injeções possíveis de apenas 5 μL de amostra, tornando-a ideal para amostras limitadas de volume. Além disso, as consequências ambientais da análise são reduzidas em relação à LC-MS devido às baixas taxas de vazão (<20 nL/min) no CESI-MS, e ao uso de eletrólitos aquosos que eliminam a necessidade de solventes orgânicos.

O método descrito é o primeiro a caracterizar as proteínas e metabólitos na coroa biomolecular NM usando a mesma amostra de plasma humano. Este método é capaz de detectar >200 proteínas e metabólitos >150, permitindo assim que a visão geral mais abrangente da coroa biomolecular completa seja determinada, permitindo uma compreensão aprimorada do apego celular, absorção e impactos dos NMs.
O uso de CESI-MS tanto para proteômica (Figura 1) quanto metabolômica(Figura 2) separação e detecção mostra boas janelas de separação em ambos os capilares para cada abordagem.
Este método é capaz de distinguir entre as proteínas na coroa em uma ampla gama de composições de NMs, demonstrando assim a aplicabilidade dos métodos aos NMs em uma ampla gama de características físicas e químicas(Tabela 1).
As impressões digitais únicas da coroa metabólito também podem ser distinguidas utilizando o ramo metabolômico desta metodologia (Figura 3). Embora essa abordagem utilize uma abordagem passiva para caracterizar a coroa metabólito NM, ainda é capaz de descobrir insights interessantes sobre o papel dos metabólitos na coroa biomolecular, como a adsorção diferencial de isômeros(Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Figura 1: Eletroferograma exemplar de uma separação de coroa de proteína SiO2 usando CESI-MS após um digestão de partículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Figura 2: Exemplo de eletroferogramas de íons extraídos obtidos de compostos endógenos no plasma por CE-MS. Os compostos numerados são os seguintes: 1. Ornithine; 2. Lysine; 3. Arginina; 4. Histidina; 5. Creatina; 6. Glycine; 7. Alanine; 8. Valine; 9. Isoleucina; 10. Leucina; 11. Serino; 12. Threonine; 13. Asparagine; 14. Methionina; 15. Glutamina; 16. Ácido glutamico; 17. Phenyl-D5-alanine; 18. Fenilalanina; 19. Tyrosine; 20. Proline; 21. Sulfone de methionina (padrão interno). Publicado sob um acesso aberto Creative Commons CC BY licença e reproduzido a partir de Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Análise da corona proteica em uma matriz de 6 NMs. Mapa de calor de classes proteicas identificadas em sílica (SiO2),titania (TiO2),TITIA tampada PVP (TiO2-PVP), titania tampada despex (TiO2-Dispex), poliestireno e poliestireno carboxilado NMs. As percentagens referem-se à abundância das proteínas em relação ao teor total de proteínas baseadas nos 3 peptídeos superiores para cada proteína. Dadas as diferenças observadas nas abundâncias relativas de proteínas nas diferentes coroas NM, é evidente que este protocolo proposto é suficientemente sensível para diferenciar entre a corona proteica de diferentes NMs. Figura reproduzida a partir de uma análise CESI-MS da proteína corona, publicada sob um acesso aberto Creative Commons CC BY licença11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Figura 3: Análise direcionada dos metabólitos cationicos na coroa NM. Adsorção de cátions para SiO2 e TiO2 NMs. Vermelho refere-se à concentração inicial de metabólitos, enquanto azul refere-se à concentração de metabólitos após uma incubação de 1 h com os NMs a 37 °C. A redução da concentração metabólica na solução é resultado da adsorção metabólica à superfície NM. Não foi observada adsorção significativa de metabólitos para as NMs de poliestireno. As parcelas da caixa representam os valores mínimo e máximo, faixas medianas e interquartil. Figura reproduzida a partir de uma análise direcionada do CESI-MS da coroa metabólica publicada sob um acesso aberto Creative Commons CC BY licença15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Figura 4: Análise direcionada dos metabólitos aniônicos na coroa NM com foco na adsorção de isômero. A adsorção de ânions para uma gama de NMs titania mostra diferenças claras entre vários isômeros, como os fosfatos de açúcar. Vermelho refere-se à concentração inicial de metabólitos, enquanto o azul refere-se à concentração de metabólitos após uma incubação de 1 h com o NM a 37 °C. A redução da concentração metabólica na solução é resultado da adsorção metabólica à superfície NM. Não foi observada adsorção significativa de metabólitos para o SiO2 e os NMs de poliestireno. As parcelas da caixa representam os valores mínimo e máximo, intervalos medianos e interquartis. Figura reproduzida a partir de uma análise direcionada do CESI-MS da coroa metabólica publicada sob um acesso aberto Creative Common CC BY licença15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analito</td>
			<td>Área de pico média do RSD</td>
			<td>Tempo médio de migração do RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 peptídeos intraday (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 ceações intra-dia (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cation inter-day (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Reprodutibilidade de réplicas técnicas do CESI-MS para peptídeos e metabólitos caônicos. RSD: desvio padrão relativo, como medida de reprodutibilidade. A reprodutibilidade do CESI-MS em termos de picos e tempos de migração é muito boa, com todos os analitos tendo um RSD médio <15% e os tempos de migração < 2,2%. Esses resultados demonstram o alto grau de confiança que pode ser atribuído aos dados coletados por essa técnica e confirmam que as variações detectadas se devem a diferenças genuínas na composição da amostra (enriquecimento em NMs) em vez de variações analíticas. A Tabela 2 é gerada a partir de resultados apresentados anteriormente11,15.

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Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Aqui apresentamos um protocolo para caracterizar a completa corona biomolecular, proteínas e metabólitos, adquiridas por nanomateriais de biofluidos usando uma eletroforese capilar – abordagem de espectrometria de massa.

Abordagens de espectrometria de massa de eletroforese capilar para caracterização da proteína e corona metabólica adquirida por nanomateriais

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-approaches-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

4.2K visualizações.  University of Birmingham. Aqui apresentamos um protocolo para caracterizar a completa corona biomolecular, proteínas e metabólitos, adquiridas por nanomateriais de biofluidos usando uma eletroforese capilar – abordagem de espectrometria de massa.

Vídeo: Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

Analisando Dynamics proteína utilizando hidrogênio câmbio Espectrometria de Massa

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Química

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Mass Spectrometric Abordagens para estudar a estrutura das proteínas e interacções em liofilizados Pós

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Usando Eletroforese Capilar para quantificar ácidos orgânicos a partir de tecido da planta: um caso de teste de exame<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Sementes

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Um ensaio de HS-MRM para a quantificação de proteínas de célula hospedeira em biofármacos de proteínas por espectrometria de massa líquida cromatografia iônica mobilidade QTOF

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Análise de respiração em tempo real usando o Nanoelectrospray secundário ionização acoplada a espectrometria de massa de alta resolução

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Síntese e análise de espectrometria de massa de Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Microsonda eletroforese capilar espectrometria de massa para célula única Metabolomics em embriões de viver rã (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Análise de arquiteturas de proteínas e complexos proteína-ligante por espectrometria de massa estrutural Integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Em grande escala proteômica de cima para baixo usando zona capilar eletroforese espectrometria de massa em Tandem

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Vigilância de drogas de alto rendimento e abrangente utilizando espectrometria de massa Multisegment eletroforese capilar-injeção

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...