A.J.C, J.A.T und I.L bestätigen Förderung durch die Europäische Kommission über horizon 2020 Projekt ACEnano (Grant No. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z erkennt Promotionsförderung durch den China Scholarship Council (CSC, Nr. 201507060011) an. R.R. erkennt die finanzielle Unterstützung des Vidi-Zuschussprogramms der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO Vidi 723.0160330) an.

Die Verwendung von Humanbiofluid wurde gemäß den IRB-Protokollrichtlinien der Universität Leiden und der Medizinischen Universität Innsbruck genehmigt. Wenn menschliche oder tierische Biofluide untersucht werden, ist eine ethische Genehmigung der Forschungseinrichtung erforderlich, die im Falle der in diesem Protokoll gezeigten Ergebnisse eingeholt wurde. Darüber hinaus sollte auch eine angemessene Berichterstattung durchgeführt werden, um Transparenz und Wiederverwendbarkeit der Daten inkünftigenArbeiten zu gewährleisten9,29,30.
1. Herstellung von Hintergrundelektrolyten (BGE)
HINWEIS: Alle Lösungsmittel sollten in einem geeigneten Abzug vorbereitet werden und für alle Schritte muss eine angemessene persönliche Schutzausrüstung verwendet werden (Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille). In jedem Schritt sind niedrig bindende Kunststofffläschchen erforderlich, um den Analytverlust und die Kontamination der Probe mit Salzen, die aus Glaswaren ausgelaucht werden, zu minimieren.
<ol><li>Bereiten Sie täglich 10% Essigsäure BGE (v / v), pH 2,2 für die Metabolomik vor.<ol>
<li>In einen 10-ml-Messkolben werden 1 ml Essigsäure hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von entionisiertem (DI) Wasser zur markierten Linie und einer gründlichen Mischung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie 100 mM Essigsäure, pH 2,9 täglich für die Proteomik vor.<ol>
<li>In einen 10-ml-Messkolben werden 57 μL Essigsäure hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von DI-Wasser zur markierten Linie und dem gründlichen Mischen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NM-Vorbereitung
<ol><li>NMs anhand der veröffentlichten Richtlinien31 , 32,33kräftig in Wasser verteilen. HINWEIS: Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurden 7 NMs wie folgt verwendet: 100 und 1.000 nm carboxyliertes Polystyrol wurden für Protein- bzw. Metabolitenkorona verwendet. 100 nm unmodifizierte Polystyrol-NMs, 13 nm Anatas-TiO2-NMs, die unverändert oder mit Polyacrylat- oder PVP-Polymeren beschichtet waren, und 22 nm unmodifizierte SiO2-NMs wurden sowohl für Protein- als auch für Metabolitenkoronen verwendet. Während die Methode mit diesen NMs entwickelt und demonstriert wurde, sollte beachtet werden, dass dieser Ansatz für eine Vielzahl von NM-Zusammensetzungen, -Größen, -Formen und -Morphologien anwendbar wäre.</li>
	<li>Charakterisierung der Partikelgröße entweder mit dynamischer Lichtstreuung34,35, Einzelpartikel-induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie36, Nanopartikel-Tracking-Analyse37oder Transmissionselektronenmikroskopie und Oberflächenladung als Zetapotential mit einem Zeta-Sizer34.</li>
</ol>3. Biomolekulare Koronabildung
<ol><li>Teilen Sie 2 ml menschliches Plasma (oder Biofluid ihrer Wahl) in 1 ml Aliquoten, eines für den Metaboliten und die Proteinkorona und das zweite für die Plasmametabolomcharakterisierung.</li>
	<li>1 mg/ml NMs im menschlichen Plasma für 1 h bei 37 °C inkubieren, während sie bei 500 U/min in einem Thermomixer sanft gemischt werden. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C, um die NMs zu pelletieren.</li>
	<li>Sammeln Sie den Plasmaüberstand für die Metabolitenkoronaanalyse. Behalten Sie den NM-Protein-Korona-Komplex für die Proteinkorona-Charakterisierung bei.</li>
</ol>4. Protein-Korona-Isolierung
<ol><li>Den NM-Proteinkomplex (das Pellet) in 1 ml 10x PBS Buffer und Wirbel kräftig für 2 min resuspendieren, um ungebundene Proteine zu entfernen. Zentrifugieren Sie die PBS-Lösung bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C, um die NMs zu pelletieren, und entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören.</li>
	<li>Das Pellet in 1 ml Ammoniumbicarbonatpuffer (ABC) (100 mM, pH 8,0) und Wirbel kräftig für 2 min resuspendieren, um ungebundene Proteine und unerwünschte Salze zu entfernen. Zentrifuge bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C, um die NMs zu pelletieren; Entfernen und verwerfen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
	<li>Reduzieren Sie Proteindisulfidbindungen, indem Sie das NM-Proteinpellet in 20 μL ABC-Puffer (100 mM pH 8) mit 10 mM Dithiotherit auflösen. Inkubieren Sie die Reduktionslösung für 30 min bei 56 °C.</li>
	<li>Um Proteine zu verdauen, fügen Sie 2 μg Trypsin in Sequenzierungsgrad zu 20 μL ABC hinzu, das 0,1% Tensid enthält. Inkubieren Sie die Fermentlösung für 16 h bei 37 °C.</li>
	<li>Alkylieren Sie die Probe durch Zugabe von 20 μL Jodoacetamid bei 55 mM in 100 mM ABC und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 20 min.</li>
	<li>Fügen Sie 20 μL von 0,1 M HCl hinzu, um das Tensid zu spalten, und lassen Sie es 10 minuten bei Raumtemperatur stehen.</li>
	<li>Anreichern und Entsalzen von Peptiden mit einer C18-verpackten Entsalzungspipettenspitze.<ol>
<li>Die Spitze mit 80 μL 0,1% Ameisensäure 50% Acetonitril 5 mal befeuchten, mit 80 μL 0,1% Ameisensäure 5 mal reinigen, Probe 10 mal ziehen und eluieren, Probe durch Spülen von 80 μL 0,1 % Ameisensäure 5 mal entsalzen und die Probe 2 mal mit 80 μL 0,1% Ameisensäure 70% Acetonitril in ein sauberes, niedrig bindendes PCR-Röhrchen eluieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Proben lyophilisieren und bis zur Analyse bei -20 °C lagern.</li>
</ol>5. Metaboliten-Korona-Isolierung
<ol><li>Nehmen Sie das Kontrollplasma und den Überstand aus der NM-Plasmainkubation aus Schritt 3.3 und halten Sie es während der Probenvorbereitung auf Eis.</li>
	<li>Nehmen Sie jeweils 50 μL in separate Durchstechflaschen und verdünnen Sie 1 zu 10 mit DI-Wasser. Nehmen Sie 50 μL jeder verdünnten Probe und wechseln Sie zu neuen Durchstechflaschen für Schritt 5.3.</li>
	<li>200 μL Chloroform, 250 μL Methanol und 350 μL DI-Wasser und kräftige Wirbelmischung für 2 min hinzufügen. Zentrifuge für 10 min bei 20.800 x g bei 4 °C.</li>
	<li>Nehmen Sie 500 μL Überstand und filtern Sie durch einen 3 kDa Zentrifugalfilter für 2 h bei 10.000 x g bei 4 °C. Nehmen Sie 430 μL Ultrafiltrat und trocknen Sie sie in einem Geschwindigkeitssauger. Proben können nun vor der Analyse eingefroren werden.</li>
</ol>6. Vorbereitung des CESI-MS-Systems38
HINWEIS: Überprüfen Sie vor der Installation der Kapillaren, ob der Einlass und das Auslassende der Kapillaren intakt sind und dass keine sichtbaren Brüche in der Kapillare vorhanden sind.
<ol><li>Installation einer neutral beschichteten Kapillare zur Proteinkoronaanalyse39.<ol>
<li>Legen Sie eine neue neutral beschichtete Kapillare (90 cm Länge mit 30 μm Innendurchmesser) gemäß den Herstellerrichtlinien in das CESI-Gerät.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von CESI-Kapillaren für die proteomische Analyse.<ol>
<li>Spülen Sie die Trennkapillar in Vorwärtsrichtung mit 100 mM HCl für 5 min bei 100 psi und überprüfen Sie die Tröpfchenbildung am Auslass der Kapillare. Spülung der Trennkapillare mit BGE bei 100 psi für 10 min und dann DI-Wasser bei 100 psi für 30 min (dies ist nur für neue Kapillaren erforderlich).</li>
		<li>Spülen Sie sowohl die Trennkapillar als auch die leitfähige Kapillare mit BGE bei 90 psi für 5 min und stellen Sie sicher, dass sich Tröpfchen am Auslassende beider Kapillaren bilden.</li>
		<li>Spülen Sie die Trennkapillare mit DI-Wasser bei 90 psi für 10 min, dann 50 psi für 10 min mit 0,1 M HCl, gefolgt von 90 psi für 10 min mit DI-Wasser und schließlich BGE bei 90 psi für 10 min. Koppeln Sie CESI mit dem MS mit einer Nanospray-Quelle und einem Adapter, wie zuvor beschrieben38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installation von blanker Quarzglaskapillare zur Metabolitenkoronacharakterisierung38.<ol>
<li>Legen Sie eine neue blanke Quarzglaskapillare (90 cm Länge mit einem Innendurchmesser von 30 μm) gemäß den Herstellerrichtlinien in das CESI-Gerät ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von CESI-Kapillaren für die Metabolomik-Analyse.<ol>
<li>Spülen Sie die Trennkapillar in Vorwärtsrichtung mit 100% MeOH bei 50 psi für 15 min und überprüfen Sie die Tröpfchenbildung am Auslass der Kapillare. Spülen Sie sowohl die Trennkapillar als auch die leitfähige Kapillare mit BGE bei 90 psi für 5 min und stellen Sie sicher, dass sich Tröpfchen am Auslass beider Kapillaren bilden.</li>
		<li>Spülen Sie die Trennkapillare mit DI-Wasser bei 90 psi für 10 min, dann 50 psi für 10 min mit 0,1 M NaOH, gefolgt von 90 psi für 10 min mit DI-Wasser und schließlich BGE bei 90 psi für 10 min. Koppeln Sie CESI mit dem ESI-MS mithilfe einer Nanospray-Quelle und eines Adapters, wie zuvor beschrieben. 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS für die Proteinkoronaanalyse
<ol><li>Proben aus Schritt 4.8 in 20 μL von 50 mM Ammoniumacetat pH 4.0 resuspendieren.</li>
	<li>Führen Sie 5 psi 10 s hydrodynamische Injektion der Probe durch. Getrennt mit einer 30 kV Trennspannung mit folgendem Druckgradienten: 0-10 min bei 1 psi, 10-35 min bei 1,5 psi und 35-45 min bei 5 psi mit 100 mM, pH 2,9 Essigsäure als BGE.</li>
	<li>Sammeln Sie Massenspektren zwischen 250-2000 m/z mit Top-10-Daten, die von der Fragmentierung abhängig sind.</li>
	<li>Zwischen den Proben die Kapillare mit 0,1 M HCl für 3 min bei 100 psi und 10 min 100 psi BGE für die Trennkapillare und für 3 min bei 100 psi für die leitfähige flüssige Kapillare ausspülen.</li>
</ol>8. CESI-MS für die Metaboliten-Korona-Analyse
HINWEIS: Alle Proben müssen zweimal analysiert werden, einmal im positiven Modus für den Nachweis von Kationen und einmal im negativen Modus für den Nachweis von Anionen. Die Kontrollplasmaproben müssen mindestens 5 Mal analysiert werden.
<ol><li>NM-exponierte und nicht exponierte Plasmaproben aus Schritt 5.4 in 430 μL DI-Wasser und kräftigem Wirbel für 2 min resuspendieren. Filtern Sie durch einen 0,1 μm Membranfilter.</li>
	<li>Nehmen Sie 95 μL Filtrat und fügen Sie 5 μL interne Standards bei 200 μM für Kationen (L-Methioninsulfon) und 400 μM für Anionen (2,2,4,4-D4-Zitronensäure) und Wirbel kräftig hinzu. Zentrifuge bei 4.000 x g bei 4 °C für 10 min vor der CESI-MS-Analyse.</li>
	<li>Die Probe hydrodynamisch für 30 s (Kationen) und 40 s (Anionen) bei 2 psi injizieren.</li>
	<li>Trennen Sie Metaboliten in 10% Essigsäure mit einer Trennspannung von 30 kV im Vorwärts- (Kationen) und Rückwärtsmodus (Anionen). Der umgekehrte Trennmodus wird mit einem Vorwärtsdruck von 0,5 psi auf die Trennkapillare unterstützt.</li>
	<li>Stellen Sie das Massenspektrometer ein, um Daten im positiven (Kationen) oder negativen (Anionen) Modus über den Massenbereich von 65-1000 m / z zu sammeln. Zwischen den Proben Die Kapillare mit 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, DI-Wasser und BGE bei 50 psi für 2 min abspülen.</li>
</ol>

J.A.T ist ein Mitarbeiter von AB Sciex UK Ltd, der als Industriepartner am ACEnano-Projekt teilnimmt, J.A.T und alle anderen Autoren haben keinen Interessenkonflikt in dieser Arbeit.

Dies ist die erste Methode, die vorgeschlagen wird, um die vollständige biomolekulare Korona mit Proteinen und Metaboliten aus derselben Probe mit CESI-MS zu charakterisieren. Die Fähigkeit, sowohl die Proteine als auch die Metaboliten aus derselben Probe zu charakterisieren, wird die Datenmenge, die aus einer einzigen experimentellen Exposition gesammelt wird, signifikant erhöhen und neue Einblicke in den Prozess der Koronabildung und ihre Auswirkungen auf die Toxizität und Wirksamkeit von NMs als Nanoarzneimittel ermöglichen. Darüber hinaus ist CESI-MS eine ideale Plattform, um beide Klassen von Biomolekülen mit nur einer Erforderlichen Kapillarveränderung zu charakterisieren. Neue Methoden, die für nicht-wässriges CE entwickelt wurden, werden es ermöglichen, Lipidomik mit CE-MS40 durchzuführen, so dass es jetzt möglich ist, Proteine, Metaboliten und Lipide mit einer einzigen Plattform zu analysieren. Die derzeitigen konventionellen Ansätze würden zwei dedizierte LC-MS-Plattformen erfordern, eine für die Proteinkorona und eine für den Metaboliten Korona. Somit kann dieser Ansatz doppelt so viele Daten mit einer einzigen Analyseplattform sammeln.
Es gibt einige Vorbehalte gegen diesen Ansatz, insbesondere mit dem Metaboliten Corona, da dieses Protokoll eine indirekte Messung der Korona vorschlägt. Daher kann ein Problem auftreten, wenn die Metabolitenspiegel in hohen Konzentrationen relativ zu den NMs vorhanden sind und der anschließende Abfall der Metabolitenkonzentration in der Matrix gering ist. Anders als bei der Proteinkorona ist es jedoch unwahrscheinlich, dass ein "one size fits all" -Ansatz zur Isolierung der Metabolitenkorona entwickelt wird, da jede NM über eine einzigartige Oberflächenchemie verfügt. In Zukunft ist es jedoch wahrscheinlicher, dass NM-spezifische Ansätze zur Isolierung des Metaboliten Corona entwickelt und validiert werden; Dies gilt nur für diesen spezifischen NM. Trotzdem wird das CESI-MS weiterhin eine sehr geeignete Plattform für die Charakterisierung der polar geladenen Metaboliten sein, unabhängig davon, wie sie isoliert werden. Bemerkenswert ist auch, dass, wenn sich während der Zentrifugationsschritte, die zur Pelletierung der NMs bestimmt sind, kein Pellet bildet, eine höhere Zentrifugalkraft erforderlich sein kann; Dies tritt am ehesten bei weniger dichten NMs auf. Es ist auch wichtig, dass alle Filterschritte innerhalb des Protokolls eingehalten werden, da die Kapillaren durch die enge Bohrung der Kapillaren leicht blockiert werden können, wenn Partikel nicht ausreichend aus der Probe entfernt wurden.
Während das Protein Corona seit einigen Jahren ein intensives Forschungsgebiet ist, ist die Fähigkeit, dies mit dem Metaboliten Corona zu kombinieren, ein neues Interessengebiet fürWissenschaftler,die die Bio-Nano-Grenzflächeuntersuchen 6,14. Bisher konzentrierte sich die Mehrzahl dieser Studien auf die unpolare Lipidfraktion des Metaboliten Korona9,28. Diese aktuelle Methode ermöglicht die Charakterisierung der hochpolaren und geladenen Metaboliten in der Korona, zu denen wichtige Metaboliten gehören, die am Energiestoffwechsel, der Glykolyse und der DNA-Synthese beteiligt sind. Dadurch ist in Kombination mit dem Proteomik-Workflow eine ganzheitlichere Charakterisierung der biomolekularen Korona möglich. Dies ermöglicht eine eingehendere Analyse von Bio-Nano-Wechselwirkungen. Diese Methode ermöglicht verbesserte mechanistische Einblicke in die rezeptorvermittelte Endozytose über Protein- und Metaboliteninteraktionen mit Membranrezeptoren. Weiterhin können inter- und intrakoronale Wechselwirkungen zwischen Proteinen und kleinen Molekülen untersucht werden; So konnte kürzlich gezeigt werden, dass die Proteine in der Korona eine Schlüsselrolle bei der Rekrutierung von Metaboliten spielen15. Es ist erwähnenswert, dass die repräsentativen Ergebnisse in Abbildung 3 und Abbildung 4 eine absolute Quantifizierung von Metaboliten sind, jedoch würde ein ungezielter Ansatz mit multivariater Datenanalyse zum Vergleich aller CE-MS-Merkmale in Kontrollen im Vergleich zu exponiertem Plasma auch die Metabolitenbindung aufklären. Daher gibt es einen erheblichen Spielraum zu untersuchen, wie und welche Metaboliten und Proteine ihre jeweilige Rekrutierung in NM-Coronas beeinflussen. Diese zusätzlichen Studien können dazu beitragen, Coronas zu entwerfen, um die Verabreichung von Nanoarzneimitteln zu optimieren oder weitere Hürden für ihre Entwicklung aufzudecken, wie die Unterdrückung der pharmazeutischen Wirkung aufgrund der biomolekularen Koronablockierung oder maskierenden Targeting-Funktionalitäten.
CESI-MS mit seinen Nano-Durchflussraten von etwa 20 nL / min und dem minimalen Einsatz organischer Lösungsmittel bietet eine Verbesserung der grünen und wirtschaftlichen Referenzen gegenüber Standard-LC-MS und NanoLC-MS in Bezug auf den Lösungsmitteleinsatz, die größten Herausforderungen für Metabolomik- bzw. Proteomik-Studien. CESI-MS bietet hochreproduzierbare Ergebnisse sowohl für die Migrationszeit als auch für den Peak-Bereich, die im Vergleich zu LC-MS-basierten Methoden11,15günstig sind. Darüber hinaus ist die Übertragung im Vergleich zu nanoLC-MS bei CESI-MS kein Problem. Daher ist keine umfangreiche Systembereinigung zwischen den Probenanalysen erforderlich, was den Probendurchsatz erheblich verbessert11.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der vorgeschlagene Workflow der erste ist, der einen Ansatz zur Charakterisierung sowohl der Protein- als auch der Metabolitenkomponenten der vollständigen biomolekularen Korona von NMs beschreibt. Dies erschließt einen neuen Aspekt der Bio-Nano-Interaktionen, den Metaboliten Corona, und ermöglicht so die Sammlung von doppelt so vielen Daten aus derselben Probe und ermöglicht ein vollständigeres Verständnis der Wechselwirkungen an der Bio-Nano-Grenzfläche.

Bio-Nano-Wechselwirkungen an der Schnittstelle zwischen Nanomaterial (NM)-Oberflächen und biologischen Matrizen, aus denen Biomoleküle an die NM adsorbieren, sind ein intensives Forschungsgebiet, das nanosicherheit und nanomedizinischuntermauert 1. Diese Schicht adsorbierender Biomoleküle verleiht NMs eine biologische Identität, so dass Zellen sie als "Selbst" identifizieren und anschließend die zelluläre Aufnahme, Verteilung und biologischen Endpunkte beeinflussen2,3,4. Die überwiegende Mehrheit der Bio-Nano-Studien hat sich auf die Proteine innerhalb der Korona konzentriert und gezeigt, dass Proteine quantitativ und qualitativ zwischen NMs unterschiedlicher Zusammensetzung variieren5. Diese Variation hängt sowohl von den Eigenschaften des NM wie Größe, Funktionalisierung und Material als auch von den Eigenschaften der biologischen Matrix einschließlich Zusammensetzung und Salzgehaltab 5. Ein zunehmendes Interesse an der Bio-Nano-Grenzfläche sind die Metaboliten, die an NMsadsorbieren 6. Mehrere Studien haben gezeigt, dass nm-Eigenschaften wie bei den Proteinen ein Schlüsselfaktor bei der Bestimmung der Zusammensetzung der Metaboliten in der Korona sind und dass sie die biologischen Ergebnisse der NM-Exposition beeinflussen können6,7,8.
In Studien der biomolekularen Korona gibt es vier verschiedene Phasen zu ihrer Charakterisierung, Koronabildung, isolierung der Biomoleküle innerhalb der Korona, deren Nachweis durch qualitative oder quantitative Massenspektrometrie und Identifizierung9. Bis heute wurde eine Reihe von Techniken zur Isolierung der Proteinkorona eingesetzt, einschließlich des Kochens in SDS-PAGE-Laufpuffern, Lösungsmittel- und Salzextraktionen oder der direkten Verdauung von Proteinen in situ auf der Oberfläche von NMs. In Bezug auf die Metaboliten in der Korona ist die Isolierung mit verschiedenen Methoden unter Verwendung von Lösungsmitteln oder sogar die Auflösung der als Lösungen vorgeschlagenen NMs8,10,11komplexer. Im Gegensatz zur Proteinkorona ist es jedoch unwahrscheinlich, dass ein "One Size Fits All"-Ansatz für die Isolierung von Metaboliten aus NMs gilt, da das Metabolom einen großen chemischen Raum einnimmt und die Möglichen NMs vielfältig sind. Ein alternativer Ansatz besteht darin, die biologische Matrix vor und nach der NM-Exposition mit dem Unterschied in den Metabolitenkonzentrationen zu charakterisieren, der auf die Adsorption von Metaboliten an NMs zurückzuführen ist.12
Dieser alternative Ansatz wäre auf alle Biofluide und NMs anwendbar und obwohl er doppelt so viel Analyse erfordert, bietet er folglich ein viel genaueres Maß für die Metabolitenkorona und hat kein Risiko, dass niedrige Metabolitenrückgewinnungen von der NM-Oberfläche mit einer geringen Bindung des spezifischen Metaboliten verwechselt werden.
Der zweite Schritt zur biomolekularen Koronaanalyse ist der Nachweis der Biomoleküle. Traditionell für die Proteine in der Korona war dies die Aufgabe von Nano-LC-MS, dem Arbeitspferd der Proteomik; andere Ansätze wie NMR13, 1D und 2D SDS-PAGE wurden ebenfalls angewendet. In Bezug auf den Metaboliten Corona LC-MS7wurden GC-MS8 und direkte Infusionsmassenspektrometrie verwendet14. In jüngster Zeit hat jedoch ein neuer Ansatz begonnen, an Zugkraft zu gewinnen, nämlich die Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS)11,15, und ist in NM-Laboren als eigenständige Technik zur Charakterisierung verschiedener physikalischer und chemischer Eigenschaften von NMs16vorhanden. CE-MS ist eine orthogonale Trenntechnik zu nanoLC-MS und GC-MS und ist in der Lage, den Nachweis von hochpolaren und geladenen Metaboliten zu ermöglichen17,18. Darüber hinaus eignet sich CE-MS gut für die Analyse von Proteinen und deren posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierung und Glykosylierung19,20,21,22. Der letzte Schritt, die Identifizierung und Datenanalyse kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden, je nachdem, ob ein quantitativer / qualitativer oder gezielter / ungezielter Ansatz verwendet wird, dies fällt jedoch nicht in den Zuständigkeitsbereich dieses Protokolls.
CESI-MS, eine Kombination aus CE und einer NanoESI-Schnittstelle, ist ein neuer Fortschritt in der CE-Technologie mit einer mantellosen Schnittstelle. Dies ermöglicht den direkten Anschluss von Ultra-Low-Flow CE (<20 nL/min) an ein hochauflösendes Massenspektrometer ohne Verdünnung, was zu einer deutlich verbesserten Detektionsempfindlichkeitführt 23,24,25. CESI-MS ermöglicht die Analyse volumenbegrennter Proben (< 10 μL) unter Beibehaltung einer hochempfindlichen Analyse26. CESI-MS ist auch im Vergleich zu herkömmlichen NanoLC-MS-Ansätzen mit niedriger Durchflussrate, die in der Proteomik und Metabolomik verwendet werden, in Bezug auf Reproduzierbarkeit27,28, Durchsatz und Übertragung günstig, was es zu einer aufregenden Perspektive für die vollständige biomolekulare Koronacharakterisierung macht.
Um das Potenzial von CESI-MS für die Analyse von Bio-Nano-Interaktionen hervorzuheben, beschreibt diese Arbeit die Probenvorbereitung, die erforderlich ist, um die biomolekulare NM-Korona aus einer einzigen menschlichen Plasmaprobe so zu isolieren, dass die Daten sowohl aus den Protein- als auch aus den Metabolitenaspekten der gesamten biomolekularen NM-Korona maximiert werden. Während wir über die Verwendung von menschlichem Plasma berichten, wäre dieses Protokoll für andere Bioflüssigkeiten wie Blutserum, komplettes Zellkulturmedium, Zelllysat, Zerebrospinalflüssigkeit oder Urin gleichermaßen geeignet. Die Analysen dieser beiden Komponenten (Proteine und Metaboliten) werden dann mit neutral beschichteten CESI-Kapillaren für die Proteinkorona und blanken Quarzglaskapillaren für kationische und anionische Metaboliten beschrieben.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,4,4-D4-citric</td>
			<td>Simga</td>
			<td>485438-1G</td>
			<td>Internal standard anion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge coolant</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>359976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 instrument</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>A98089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Cap</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B24699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Vials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650498</td>
			<td>Toxic, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 1mol/L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iosoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine sulfone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0876-1G</td>
			<td>Internal standard cation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14262</td>
			<td>Use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoVials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5043467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Surface Cartridge 30 &#181;M ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07363</td>
			<td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &#181;m ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahte buffered saline 10x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips, 100 &#181;L bed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>16688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>08226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapigest SF (surfactant)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiO2 Ludox TM-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>420786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide solution</td>
			<td>Simga</td>
			<td>72079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 Dispex coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 PVP coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 uncoated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

Die Adsorption von Biomolekülen aus umgebenden biologischen Matrizen an die Oberfläche von Nanomaterialien (NMs) zur Bildung der Korona ist seit einem Jahrzehnt von Interesse. Das Interesse an der Bio-Nano-Grenzfläche ergibt sich daraus, dass die biomolekulare Korona NMs eine biologische Identität verleiht und so den Körper veranlasst, sie als "Selbst" zu identifizieren. Zum Beispiel haben frühere Studien gezeigt, dass die Proteine in der Korona in der Lage sind, mit Membranrezeptoren zu interagieren, um die zelluläre Aufnahme zu beeinflussen, und festgestellt, dass die Korona für den zellulären Transport von NMs und deren eventuelle Toxizität verantwortlich ist. Bisher hat sich die meiste Forschung auf die Proteinkorona konzentriert und die möglichen Auswirkungen der in der Korona enthaltenen Metaboliten oder synergistische Effekte zwischen Komponenten in der gesamten biomolekularen Korona übersehen. Daher zeigt diese Arbeit Methoden, um sowohl die Protein- als auch die Metabolitenkomponenten der biomolekularen Korona unter Verwendung von Bottom-up-Proteomik- und Metabolomik-Ansätzen parallel zu charakterisieren. Dazu gehören eine On-Particle-Digest der Proteinkorona mit einem Tensid zur Erhöhung der Proteinrückgewinnung und eine passive Charakterisierung der Metabolitenkorona durch Analyse von Metabolitenmatrizen vor und nach NM-Expositionen. Diese Arbeit führt die Kapillarelektrophorese – Massenspektrometrie (CESI-MS) als neue Technik zur NM-Koronacharakterisierung ein. Die hier beschriebenen Protokolle zeigen, wie CESI-MS für die zuverlässige Charakterisierung sowohl des Proteins als auch der Metabolitenkorona, die von NMs erworben werden, verwendet werden kann. Der Wechsel zu CESI-MS verringert das erforderliche Probenvolumen erheblich (im Vergleich zu herkömmlichen Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-Ansätzen (LC-MS) mit mehreren Injektionen ab nur 5 μL Probe, was es ideal für volumenbegrente Proben macht. Darüber hinaus werden die Umweltfolgen der Analyse in Bezug auf LC-MS aufgrund der niedrigen Durchflussraten (<20 nL / min) in CESI-MS und der Verwendung von wässrigen Elektrolyten, wodurch organische Lösungsmittel überflüssig werden, reduziert.

Die beschriebene Methode ist die erste, die sowohl die Proteine als auch die Metaboliten in der biomolekularen NM-Korona mit derselben menschlichen Plasmaprobe charakterisiert. Diese Methode ist in der Lage, >200 Proteine und >150-Metaboliten nachzuweisen, wodurch ein möglichst umfassender Überblick über die gesamte biomolekulare Korona bestimmt werden kann, was ein besseres Verständnis der zellulären Bindung, Aufnahme und Auswirkungen von NMs ermöglicht.
Die Verwendung von CESI-MS sowohl für die Proteomik (Abbildung 1) als auch für die Metabolomik (Abbildung 2) trennung und detektion zeigt gute Trennfenster an beiden Kapillaren für jeden Ansatz.
Diese Methode ist in der Lage, zwischen den Proteinen in der Korona über eine breite Palette von NMs-Zusammensetzungen zu unterscheiden und so die Anwendbarkeit der Methoden auf NMs über ein breites Spektrum physikalischer und chemischer Eigenschaften zu demonstrieren (Tabelle 1).
Die eindeutigen Fingerabdrücke des Metaboliten Korona können auch mit dem metabolomischen Zweig dieser Methodik unterschieden werden (Abbildung 3). Obwohl dieser Ansatz einen passiven Ansatz zur Charakterisierung der NM-Metabolitenkorona verwendet, ist er immer noch in der Lage, interessante Einblicke in die Rolle von Metaboliten in der biomolekularen Korona wie die differentielle Adsorption von Isomeren zu gewinnen (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Abbildung 1: Beispiel-Elektropherogramm einer SiO2-Proteinkoronatrennung mittels CESI-MS nach einem On-Particle-Digest. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Abbildung 2: Beispiel für extrahierte Ionenelektropherogramme, die aus endogenen Verbindungen im Plasma durch CE-MS gewonnen wurden. Die nummerierten Verbindungen sind wie folgt: 1. Ornithin; 2. Lysin; 3. Arginin; 4. Histidin; 5. Kreatin; 6. Glycin; 7. Alanin; 8. Valin; 9. Isoleucin; 10. Leucin; 11. Serin; 12. Threonin; 13. Asparagin; 14. Methionin; 15. Glutamin; 16. Glutaminsäure; 17. Phenyl-D5-Alanin; 18. Phenylalanin; 19. Tyrosin; 20. Prolin; 21. Methioninsulfon (interner Standard). Veröffentlicht unter einer Open-Access-Lizenz von Creative Commons CC BY und reproduziert von Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Analyse der Proteinkorona über ein Array von 6 NMs. Heatmap der Proteinklassen, die auf Kieselsäure(SiO2),Titan (TiO2), PVP-gekapptes Titan (TiO2-PVP), dispex-gekapptes Titan (TiO2-Dispex), Polystyrol und carboxyliertes Polystyrol-NMs identifiziert wurden. Prozentsätze beziehen sich auf die Häufigkeit der Proteine im Verhältnis zum Gesamtproteingehalt basierend auf der Top-3-Peptidhäufigkeit für jedes Protein. Angesichts der Beobachteten Unterschiede in den relativen Häufigkeiten von Proteinen in den verschiedenen NM-Koronen ist es klar, dass dieses vorgeschlagene Protokoll ausreichend empfindlich ist, um zwischen der Proteinkorona verschiedener NMs zu unterscheiden. Abbildung reproduziert aus einer CESI-MS-Analyse der Proteinkorona, veröffentlicht unter einem Open Access Creative Commons CC BY Lizenz11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Abbildung 3: Gezielte Analyse der kationischen Metaboliten in der NM-Korona. Adsorption von Kationen anSiO2 undTiO2 NMs. Rot bezieht sich auf die Anfangskonzentration von Metaboliten, während Blau sich auf die Konzentration von Metaboliten nach einer 1 h Inkubation mit den NMs bei 37 °C bezieht. Die Verringerung der Metabolitenkonzentration in der Lösung ist das Ergebnis der Metabolitenadsorption an der NM-Oberfläche. Für die Polystyrol-NMs wurde keine signifikante Adsorption von Metaboliten beobachtet. Box-Diagramme stellen die Minimal- und Maximalwerte, Median- und Interquartilbereiche dar. Abbildung reproduziert aus einer CESI-MS-gezielten Analyse des Metaboliten Corona, die unter einer Open-Access-Creative Commons CC BY-Lizenz15veröffentlicht wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Abbildung 4: Gezielte Analyse der anionischen Metaboliten in der NM-Korona mit Fokus auf Isomerenadsorption. Die Adsorption von Anionen an eine Reihe von Titan-NMs zeigt deutliche Unterschiede zwischen verschiedenen Isomeren wie den Zuckerphosphaten. Rot bezieht sich auf die Anfangskonzentration von Metaboliten, während Blau auf die Konzentration von Metaboliten nach einer 1 h Inkubation mit dem NM bei 37 °C verweist. Die Verringerung der Metabolitenkonzentration in Lösung ist das Ergebnis der Metabolitenadsorption an der NM-Oberfläche. FürsiO2 und die Polystyrol-NMs wurde keine signifikante Adsorption von Metaboliten beobachtet. Box-Diagramme stellen die Minimal- und Maximalwerte, Median- und Interquartilsbereiche dar. Abbildung reproduziert aus einer CESI-MS-gezielten Analyse des Metaboliten Corona, die unter einer Open-Access-Lizenz von Creative Common CC BY15veröffentlicht wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analyt</td>
			<td>Mittlere RSD-Spitzenfläche</td>
			<td>Mittlere RSD-Migrationszeit</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 Peptide intraday (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 Kationen intraday (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 Kationen intertags (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Reproduzierbarkeit von technischen CESI-MS-Replikaten für Peptide und kationische Metaboliten. RSD: relative Standardabweichung als Maß für die Reproduzierbarkeit. Die Reproduzierbarkeit von CESI-MS in Bezug auf Spitzengebiete und Migrationszeiten ist sehr gut, wobei alle Analyten einen mittleren RSD-<15% und Migrationszeiten <2,2% aufweisen. Diese Ergebnisse zeigen das hohe Maß an Vertrauen, das den mit dieser Technik gesammelten Daten zugeschrieben werden kann, und bestätigen, dass die festgestellten Variationen eher auf echte Unterschiede in der Probenzusammensetzung (Anreicherung auf NMs) als auf analytische Variationen zurückzuführen sind. Tabelle 2 wird aus den zuvor dargestellten Ergebnissen11,15generiert.

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Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Charakterisierung der vollständigen biomolekularen Korona, Proteine und Metaboliten, die von Nanomaterialien aus Biofluiden unter Verwendung eines Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie-Ansatzes gewonnen werden.

Kapillarelektrophorese Massenspektrometrie Ansätze zur Charakterisierung der protein- und metaboliten Korona, die von Nanomaterialien erfasst werden

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

4.2K Aufrufe.  University of Birmingham. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Charakterisierung der vollständigen biomolekularen Korona, Proteine und Metaboliten, die von Nanomaterialien aus Biofluiden unter Verwendung eines Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie-Ansatzes gewonnen werden.

Serie: Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

Analyse von Proteindynamik mit Wasserstoffwechsel Massenspektrometrie

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Forschung

Chemie

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Massenspektrometrische Ansätze zur Proteinstruktur und Wechselwirkungen zu untersuchen in lyophilisierte Pulver

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Mit Hilfe der Kapillarelektrophorese organischen Säuren aus Pflanzengewebe zu beziffern: ein Test Untersuchen<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Saatgut

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Ein HS-MRM-Assay für die Quantifizierung der Wirtszelle Proteine in Protein Biopharmazeutika durch flüssige Chromatographie Ion Mobility QTOF Massenspektrometrie

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Echtzeit-Atem-Analyse mithilfe von sekundären Nanoelectrospray Ionisation mit hochauflösenden Massenspektrometrie gekoppelt

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Synthese- und Massenspektrometrie der Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Mikrosonde Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry für einzellige Metabolomik in Live-Frosch (Xenopus Laevis) Embryonen

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Analyse von Protein-Architekturen und Protein-Ligand-komplexen durch Integrative strukturelle Massenspektrometrie

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Groß angelegte Top-Down-Proteomik mit Kapillare Zone Elektrophorese Tandem-Massenspektrometrie

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

High-Throughput und umfassende Droge-Überwachung mittels Massenspektrometrie Multisegment-Injektion-Kapillar-Elektrophorese

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...