A.J.C, J.A.T e I.L riconoscono il finanziamento della Commissione Europea tramite il progetto Horizon 2020 ACEnano (Grant no. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z riconosce il finanziamento del dottorato di ricerca dal China Scholarship Council (CSC, No. 201507060011). R.R riconosce il sostegno finanziario del programma di sovvenzioni Vidi dell'Organizzazione olandese della ricerca scientifica (NWO Vidi 723.0160330).

L'uso di biofluidi umani è stato approvato secondo le linee guida del protocollo IRB dell'Università di Leida e dell'Università di Medicina di Innsbruck. Quando si studiano biofluidi umani o animali, è necessaria l'approvazione etica da parte dell'istituto di ricerca ed è stata ottenuta nel caso dei risultati mostrati in questo protocollo. Inoltre, dovrebbero essere effettuate relazioni adeguate per garantire la trasparenza e la riutilizzabilità dei dati nei futuri lavori9,29,30.
1. Preparazione di elettroliti di fondo (BGE)
NOTA: Tutti i solventi devono essere preparati in un'adeguata cappa aspirante e devono essere utilizzati adeguati dispositivi di protezione individuale per tutte le fasi (labcoat, guanti e occhiali). In ogni fase, sono necessari flaconcini di plastica a bassa legatura per ridurre al minimo la perdita di analita e la contaminazione del campione con sali lisciviati dalla vetreria.
<ol><li>Preparare il 10% di acido acetico BGE (v / v), pH 2,2 su base giornaliera per la metabolomica.<ol>
<li>In un matraccio volumetrico da 10 ml aggiungere 1 mL di acido acetico, seguito dall'aggiunta di acqua deionizzata (DI) alla linea contrassegnata e da un'accurata miscelazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare 100 mM di acido acetico, pH 2,9 su base giornaliera per la proteomica.<ol>
<li>In un matraccio volumetrico da 10 ml aggiungere 57 μL di acido acetico, seguito dall'aggiunta di acqua DI alla linea contrassegnata e da un'accurata miscelazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione NM
<ol><li>Disperdere vigorosamente i NG in acqua utilizzando le linee guida pubblicate31,32,33. NOTA: Nello sviluppo di questo protocollo, sono stati utilizzati 7 NM come segue: 100 e 1.000 nm di polistirene carbossilato sono stati utilizzati rispettivamente per la proteina e il metabolita corona. 100 nm di POLISTIRENE NON MODIFICATO NMs, 13 nm anatasi TiO2 NM che erano non modificati o rivestiti con polimeri poliacrilati o PVP e 22 nm non modificato SiO2 NM nMs sono stati utilizzati sia per le corone proteiche che per i metaboliti. Mentre il metodo è stato sviluppato e dimostrato utilizzando questi NM, va notato che questo approccio sarebbe applicabile per una vasta gamma di composizioni, dimensioni, forme e morfologie NM.</li>
	<li>Caratterizzare la dimensione delle particelle utilizzando la diffusione dinamica della luce34,35,la spettrometria di massa al plasma accoppiata induttivamente a singola particella36,l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle37o la microscopia elettronica a trasmissione e la carica superficiale come potenziale zeta utilizzando un zeta sizer34.</li>
</ol>3. Formazione di corona biomolecolare
<ol><li>Dividere 2 mL di plasma umano (o biofluido a scelta) in aliquote da 1 mL, una per il metabolita e la proteina corona e la seconda per la caratterizzazione del metaboloma plasmatico.</li>
	<li>Incubare 1 mg/mL di NMs nel plasma umano per 1 ora a 37 °C mescolando delicatamente a 500 rpm in un bimbyxer. Dopo l'incubazione centrifugare il campione a 4.000 x g per 15 min a 4 °C per pellettizzare le RM.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante plasmatico per l'analisi del metabolita corona. Mantenere il complesso corona NM-proteina per la caratterizzazione della corona proteica.</li>
</ol>4. Isolamento della corona proteica
<ol><li>Risospendare il complesso NM-proteina (il pellet) in 1 mL di 10x PBS Buffer e vortice vigorosamente per 2 minuti per rimuovere le proteine non legate. Centrifugare la soluzione PBS a 4.000 x g per 15 min a 4 °C per pellettizzare le NN e rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet.</li>
	<li>Risospendare il pellet in 1 mL di tampone di bicarbonato di ammonio (ABC) (100 mM, pH 8,0) e vortici vigorosamente per 2 minuti per rimuovere le proteine non legate e i sali indesiderati. Centrifugare a 4.000 x g per 15 min a 4 °C per pellettizzare i NN; rimuovere ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio.</li>
	<li>Ridurre i legami disolfuro proteico sciogliendo il pellet di proteina NM in 20 μL di tampone ABC (100 mM pH 8) contenente 10 mM di ditioteritolo. Incubare la soluzione di riduzione per 30 minuti a 56 °C.</li>
	<li>Per digerire le proteine, aggiungere 2 μg di tripsina di grado sequenziale a 20 μL di ABC contenente lo 0,1% di tensioattivo. Incubare la soluzione digestiva per 16 ore a 37 °C.</li>
	<li>Alchilare il campione con l'aggiunta di 20 μL di iodoacetammide a 55 mM in 100 mM ABC e incubare a temperatura ambiente per 20 min.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL di 0,1 M HCl per fendere il tensioattivo e lasciare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Arricchire e desalt peptidi utilizzando una punta della pipetta dissalatrice confezionata C18.<ol>
<li>Bagnare la punta con 80 μL 0,1% acido formico 50% acetonitrile 5 volte, pulire con 80 μL 0,1% acido formico 5 volte, prelevare ed eluire il campione 10 volte, desaltare il campione lavando 80 μL 0,1% acido formico 5 volte ed eluire il campione 2 volte con 80 μL 0,1% acido formico 70% acetonitrile in un tubo PCR pulito a bassa legante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Liofilizzare i campioni e conservare a -20 °C fino all'analisi.</li>
</ol>5. Isolamento del metabolita corona
<ol><li>Prendere il plasma di controllo e il surnatante dall'incubazione del plasma NM dalla fase 3.3 e mantenere il ghiaccio durante la preparazione del campione.</li>
	<li>Prendere 50 μL da ciascuno in flaconcini separati e diluire 1 su 10 con acqua DI. Prendere 50 μL di ciascun campione diluito e passare a nuovi flaconcini per il passaggio 5.3.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di cloroformio, 250 μL di metanolo e 350 μL di acqua DI e una miscela vigorosamente a vortice per 2 min. Centrifuga per 10 min a 20.800 x g a 4 °C.</li>
	<li>Prendere 500 μL di surnatante e filtrare attraverso un filtro centrifugo da 3 kDa per 2 ore a 10.000 x g a 4 °C. Prendere 430 μL di ultrafiltrato e asciugare in una velocità vac. I campioni possono ora essere congelati prima dell'analisi.</li>
</ol>6. Preparazione del sistema CESI-MS38
NOTA: Prima dell'installazione dei capillari, controllare che l'ingresso e l'estremità di uscita dei capillari siano intatti e che non vi siano rotture visibili nel capillare.
<ol><li>Installazione di un capillare rivestito neutro per l'analisi della corona proteica39.<ol>
<li>Inserire un nuovo capillare rivestito neutro (lunghezza 90 cm con diametro interno di 30 μm) nello strumento CESI seguendo le linee guida del produttore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di capillari CESI per analisi proteomiche.<ol>
<li>Lavare il capillare di separazione in avanti utilizzando 100 mM di HCl per 5 minuti a 100 psi e verificare la presenza di goccioline all'uscita del capillare. Separazione capillare a filo con BGE a 100 psi per 10 min e poi acqua DI a 100 psi per 30 min (questo è richiesto solo per i nuovi capillari).</li>
		<li>Lavare sia il capillare di separazione che il capillare conduttivo con BGE a 90 psi per 5 minuti e assicurarsi che si formino goccioline all'estremità di uscita di entrambi i capillari.</li>
		<li>Lavare il capillare di separazione con acqua DI a 90 psi per 10 min, poi 50 psi per 10 min con 0,1 M HCl, seguito di nuovo da 90 psi per 10 min con acqua DI e infine BGE a 90 psi per 10 min. Accoppia CESI alla SM utilizzando una sorgente nanospray e un adattatore come descritto in precedenza38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installazione di capillare di silice fusa nuda per la caratterizzazione della corona del metabolita38.<ol>
<li>Inserire un nuovo capillare di silice fusa nuda (lunghezza 90 cm con un diametro interno di 30 μm) nello strumento CESI seguendo le linee guida del produttore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione dei capillari CESI per l'analisi metabolomica.<ol>
<li>Lavare il capillare di separazione in avanti utilizzando MeOH al 100% a 50 psi per 15 minuti e verificare la presenza di goccioline all'uscita del capillare. Lavare sia il capillare di separazione che il capillare conduttivo con BGE a 90 psi per 5 minuti e assicurarsi che si formino goccioline all'uscita di entrambi i capillari.</li>
		<li>Lavare il capillare di separazione con acqua DI a 90 psi per 10 min, poi 50 psi per 10 min con 0,1 M NaOH, seguito di nuovo da 90 psi per 10 min con acqua DI e infine BGE a 90 psi per 10 min. Accoppia cesio all'ESI-MS utilizzando una sorgente nanospray e un adattatore come descritto in precedenza. 38 anni
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS per l'analisi della corona proteica
<ol><li>Sospendare i campioni dallo step 4.8 in 20 μL di 50 mM di acetato di ammonio pH 4.0.</li>
	<li>Eseguire l'iniezione idrodinamica 5 psi 10 s del campione. Separare utilizzando una tensione di separazione di 30 kV con il seguente gradiente di pressione: 0-10 min a 1 psi, 10-35 min a 1,5 psi e 35-45 min a 5 psi usando 100 mM, pH 2,9 acido acetico come BGE.</li>
	<li>Raccogli spettri di massa tra 250-2000 m/z con l'acquisizione di frammentazione dipendente dai dati top-10.</li>
	<li>Tra i campioni, risciacquare capillarmente con 0,1 M HCl per 3 min a 100 psi e 10 min 100 psi di BGE per la separazione capillare e per 3 min a 100 psi per il liquido conduttivo capillare.</li>
</ol>8. CESI-MS per l'analisi del metabolita corona
NOTA: Tutti i campioni devono essere analizzati due volte, una volta in modalità positiva per il rilevamento dei cationi e una volta in modalità negativa per la rilevazione degli anioni. I campioni di plasma di controllo devono essere analizzati almeno 5 volte.
<ol><li>Sospendare i campioni di plasma esposti e non esposti al NM dal passo 5.4 in 430 μL di acqua DI e vortice vigoroso per 2 min. Filtrare attraverso un filtro a membrana da 0,1 μm.</li>
	<li>Prendere 95 μL di filtrato e aggiungere 5 μL di standard interni a 200 μM per i cationi (L-metionina solfone) e 400 μM per gli anioni (acido 2,2,4,4-D4-citrico) e vortice vigorosamente. Centrifugare a 4.000 x g a 4 °C per 10 minuti prima dell'analisi CESI-MS.</li>
	<li>Iniettare il campione idrodinamicamente per 30 s (cationi) e 40 s (anioni) a 2 psi.</li>
	<li>Separare i metaboliti in acido acetico al 10% con una tensione di separazione di 30 kV in modalità avanti (cationi) e inversa (anioni). La modalità di separazione inversa è assistita da una pressione in avanti di 0,5 psi sul capillare di separazione.</li>
	<li>Impostare lo spettrometro di massa per raccogliere dati in modalità positiva (cationi) o negativa (anioni) nell'intervallo di massa 65-1000 m/z. Tra i campioni, risciacquare capillarmente con 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, acqua DI e BGE a 50 psi per 2 min.</li>
</ol>

J.A.T è un dipendente di AB Sciex UK Ltd che partecipa come partner industriale al progetto ACEnano, J.A.T e tutti gli altri autori non hanno conflitti di interesse in questo lavoro.

Questo è il primo metodo proposto per caratterizzare la corona biomolecolare completa incorporando proteine e metaboliti, dallo stesso campione, utilizzando CESI-MS. La capacità di caratterizzare sia le proteine che i metaboliti dello stesso campione aumenterà significativamente la quantità di dati raccolti da una singola esposizione sperimentale consentendo nuove informazioni sul processo di formazione della corona e sui suoi impatti per la tossicità e l'efficacia delle NN come nanofarmaci. Inoltre, CESI-MS è una piattaforma ideale per caratterizzare entrambe le classi di biomolecole con un solo cambio di capillare richiesto. Andando avanti, nuovi metodi sviluppati per la CE non acquosa consentiranno di eseguire la lipidomica utilizzando CE-MS40, quindi è ora possibile analizzare proteine, metaboliti e lipidi utilizzando un'unica piattaforma. Gli attuali approcci convenzionali richiederebbero due piattaforme LC-MS dedicate, una per la proteina corona e una per il metabolita corona. Pertanto, questo approccio può raccogliere il doppio dei dati utilizzando una singola piattaforma analitica.
Ci sono alcuni avvertimenti a questo approccio in particolare con il metabolita corona in quanto questo protocollo propone una misurazione indiretta della corona. Come tale, il problema può sorgere quando i livelli di metaboliti sono presenti ad alte concentrazioni rispetto alle NN e il successivo calo della concentrazione di metaboliti nella matrice è piccolo. Tuttavia, a differenza della corona proteica, è improbabile che venga sviluppato un approccio "taglia unica" per isolare il metabolita corona a causa del fatto che ogni NM ha sostanze chimiche di superficie uniche. Andando avanti è più probabile che vengano sviluppati e convalidati approcci specifici per la NM per isolare il metabolita corona; questo sarà applicabile solo a quello specifico NM. Nonostante ciò, il CESI-MS sarà comunque una piattaforma altamente adatta per la caratterizzazione dei metaboliti polari carichi indipendentemente da come sono isolati. Degno di nota è anche il fatto che se un pellet non si forma durante le fasi di centrifugazione progettate per pellettare le NM, può essere necessaria una forza centrifuga più elevata; questo è più probabile che si verifichi con NN meno densi. È anche fondamentale che tutte le fasi di filtraggio siano rispettate all'interno del protocollo a causa dello stretto foro dei capillari che possono facilmente bloccarsi se il particolato non è stato adeguatamente eliminato dal campione.
Mentre la proteina corona è stata un'intensa area di ricerca per un certo numero di anni, la capacità di combinarlo con il metabolita corona è un nuovo campo di interesse per gli scienziati che studiano l'interfaccia bio-nano6,14. Ad oggi, la maggior parte di questi studi si è concentrata sulla frazione lipidica non polare del metabolita corona9,28. Questo metodo attuale consente la caratterizzazione dei metaboliti altamente polari e carichi nella corona che include importanti metaboliti coinvolti nel metabolismo energetico, nella glicolisi e nella sintesi del DNA. Di conseguenza, se combinato con il flusso di lavoro proteomico, è possibile una caratterizzazione più olistica della corona biomolecolare. Ciò consente un'analisi più approfondita delle interazioni bio-nano in futuro. Questo metodo consente una migliore conoscenza meccanicistica dell'endocitosi mediata dai recettori attraverso le interazioni di proteine e metaboliti con i recettori di membrana. Inoltre, possono essere esplorate le interazioni inter e intra corona tra proteine e piccole molecole; ad esempio, è stato recentemente dimostrato che le proteine nella corona svolgono un ruolo chiave nel reclutamento dei metaboliti15. Vale la pena notare che i risultati rappresentativi nella Figura 3 e nella Figura 4 sono la quantificazione assoluta dei metaboliti, tuttavia, un approccio non targeting che utilizza l'analisi dei dati multivariati per confrontare tutte le caratteristiche CE-MS nei controlli rispetto al plasma esposto chiarirebbe anche il legame con il metabolita. Pertanto, c'è uno spazio significativo per indagare come e quali metaboliti e proteine influenzano il loro rispettivo reclutamento nelle corone NM. Questi studi aggiuntivi possono aiutare a progettare corone per ottimizzare la consegna di nanofarmaci o scoprire ulteriori ostacoli al loro sviluppo come la soppressione dell'azione farmaceutica a causa del blocco biomolecolare della corona o delle funzionalità di targeting del mascheramento.
CESI-MS con le sue portate su scala nanometrica di circa 20 nL/ min e l'uso minimo di solventi organici offre un miglioramento delle credenziali verdi ed economiche rispetto agli standard LC-MS e nanoLC-MS in termini di uso di solventi, le principali sfide per gli studi di metabolomica e proteomica, rispettivamente. CESI-MS offre risultati altamente riproducibili sia per il tempo di migrazione che per l'area di picco che si confrontano favorevolmente con i metodi basati su LC-MS11,15. Inoltre, rispetto ai nanoLC-MS, il carry-over non è un problema nel CESI-MS. Pertanto, non è necessaria un'ampia pulizia del sistema tra le analisi dei campioni, il che migliora notevolmente la produttività del campione11.
In sintesi, il flusso di lavoro proposto è il primo a dettagliare un approccio per caratterizzare sia le componenti proteiche che metabolite della corona biomolecolare completa delle RM. Ciò sblocca un nuovo aspetto delle interazioni bio-nano, il metabolita corona, consentendo così la raccolta di due volte più dati dallo stesso campione, consentendo una comprensione più completa delle interazioni all'interfaccia bio-nano.

Le interazioni bio-nano, all'interfaccia tra superfici di nanomateriali (NM) e matrici biologiche da cui le biomolecole assorbono al NM, sono un'intensa area di ricerca alla base della nanosicurezza e della nanomedicina1. Questo strato di biomolecole adsorbite conferisce un'identità biologica alle RM, quindi le cellule le identificano come "sé", influenzando successivamente l'assorbimento cellulare, la distribuzione e gli endpoint biologici2,3,4. La stragrande maggioranza degli studi bio-nano si è concentrata sulle proteine all'interno della corona e ha dimostrato che le proteine variano quantitativamente e qualitativamente tra LE NN di diverse composizioni5. Questa variazione dipende sia dalle proprietà del NM come dimensioni, funzionalizzazione e materiale, sia dalle proprietà della matrice biologica, compresa la composizione e il contenuto di sale5. Una crescente area di interesse nell'interfaccia bio-nano sono i metaboliti che assorbono aNN 6. Diversi studi hanno dimostrato che, come per le proteine, le proprietà NM sono un fattore chiave nel determinare la composizione dei metaboliti nella corona e che possono influenzare gli esiti biologici dell'esposizione a NM6,7,8.
Negli studi della corona biomolecolare ci sono quattro fasi distinte per la sua caratterizzazione, la formazione della corona, l'isolamento delle biomolecole all'interno della corona, la loro rilevazione tramite spettrometria di massa qualitativa o quantitativa e l'identificazione9. Ad oggi, sono state adottate una serie di tecniche per isolare la corona proteica, tra cui l'ebollizione nel tampone di funzionamento SDS-PAGE, le estrazioni con solvente e sale o la digestione diretta delle proteine in situ sulla superficie delle RM. In termini di metaboliti nella corona, l'isolamento è più complesso con vari metodi che utilizzano solventi o anche la dissoluzione dei NN proposti come soluzioni8,10,11. Tuttavia, a differenza della corona proteica, è improbabile che un approccio "taglia unica" si applichi all'isolamento dei metaboliti dalle MM, a causa dell'ampio spazio chimico occupato dal metaboloma e della diversità dei possibili MM. Un approccio alternativo consiste nel caratterizzare la matrice biologica prima e dopo l'esposizione a NM con la differenza nelle concentrazioni di metaboliti attribuita all'adsorbimento dei metaboliti alle NM.12
Questo approccio alternativo sarebbe applicabile a tutti i biofluidi e NM e, sebbene richieda il doppio dell'analisi, offre di conseguenza una misura molto più precisa del metabolita corona e non ha alcun rischio che i recuperi a basso metabolita dalla superficie NM vengano scambiati per basso legame del metabolita specifico.
Il secondo passo per l'analisi biomolecolare della corona è la rilevazione delle biomolecole. Tradizionalmente per le proteine nella corona, questo è stato il mandato della nano-LC-MS, il cavallo di battaglia della proteomica; sono stati applicati anche altri approcci come NMR13, 1D e 2D SDS-PAGE. In termini di metabolita corona LC-MS7,GC-MS8 e spettrometria di massa ad infusione diretta sono stati utilizzati14. Tuttavia, un nuovo approccio ha recentemente iniziato a guadagnare trazione, vale a dire elettroforesi capillare-spettrometria di massa (CE-MS)11,15 ed è stato presente nei laboratori NM come tecnica autonoma per caratterizzare varie proprietà fisiche e chimiche di NM16. CE-MS è una tecnica di separazione ortogonale a nanoLC-MS e GC-MS ed è in grado di consentire la rilevazione di metaboliti altamente polari e carichi17,18. Inoltre, CE-MS è adatto per l'analisi delle proteine e delle loro modificazioni post-traduzionali come la fosforilazione e la glicosilazione19,20,21,22. La fase finale, l'identificazione e l'analisi dei dati possono essere eseguite in diversi modi a seconda che venga utilizzato un approccio quantitativo / qualitativo o mirato / non mirato, questo, tuttavia, esula dal mandato di questo protocollo.
CESI-MS, una combinazione di CE e un'interfaccia nanoESI, è un recente progresso nella tecnologia CE che utilizza un'interfaccia senza guai. Ciò consente il collegamento diretto di CE a flusso ultra-basso (<20 nL / min) a uno spettrometro di massa ad alta risoluzione senza diluizione, con conseguente sensibilità di rilevamento significativamente migliorata23,24,25. CESI-MS consente di analizzare campioni a volume limitato (< 10 μL) mantenendo un'analisi altamente sensibile26. CESI-MS si confronta anche favorevolmente con i tradizionali approcci nanoLC-MS a bassa portata utilizzati in proteomica e metabolomica in termini di riproducibilità27,28,throughput e carry over, rendendolo una prospettiva entusiasmante per la caratterizzazione completa della corona biomolecolare.
Per evidenziare il potenziale del CESI-MS per le analisi delle interazioni bio-nano, questo lavoro descrive la preparazione del campione necessaria per isolare la corona biomolecolare NM da un singolo campione di plasma umano in modo tale da massimizzare i dati sia dagli aspetti proteici che da quelli metabolitici della corona NM biomolecolare completa. Mentre riportiamo sull'uso del plasma umano, questo protocollo sarebbe ugualmente appropriato per altri biofluidi come il siero del sangue, il terreno di coltura cellulare completo, il lisato cellulare, il liquido cerebrospinale o l'urina. Le analisi di questi due componenti (proteine e metaboliti) saranno poi descritte utilizzando capillari CESI rivestiti neutri per la corona proteica e capillari di silice fusi nudi per metaboliti sia cationici che anionici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,4,4-D4-citric</td>
			<td>Simga</td>
			<td>485438-1G</td>
			<td>Internal standard anion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate &#62;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge coolant</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>359976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI 8000 instrument</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>A98089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Cap</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B24699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CESI Vials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650498</td>
			<td>Toxic, use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 1mol/L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iosoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine sulfone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0876-1G</td>
			<td>Internal standard cation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14262</td>
			<td>Use in a fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoVials</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>5043467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Surface Cartridge 30 &#181;M ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07363</td>
			<td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &#181;m ID x 90 cm total length</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospahte buffered saline 10x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips, 100 &#181;L bed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>16688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td>
			<td>Polysciences Inc</td>
			<td>08226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapigest SF (surfactant)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiO2 Ludox TM-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>420786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide solution</td>
			<td>Simga</td>
			<td>72079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 Dispex coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 PVP coated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 uncoated</td>
			<td>Promethion particles</td>
			<td>Bespoke particles</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

L'adsorbimento delle biomolecole dalle matrici biologiche circostanti alla superficie dei nanomateriali (NN) per formare la corona è stato di interesse negli ultimi dieci anni. L'interesse per l'interfaccia bio-nano nasce dal fatto che la corona biomolecolare conferisce un'identità biologica alle RM e quindi induce il corpo a identificarle come "sé". Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato che le proteine nella corona sono in grado di interagire con i recettori di membrana per influenzare l'assorbimento cellulare e hanno stabilito che la corona è responsabile del traffico cellulare di NG e della loro eventuale tossicità. Ad oggi, la maggior parte della ricerca si è concentrata sulla proteina corona e ha trascurato i possibili impatti dei metaboliti inclusi nella corona o gli effetti sinergici tra i componenti della corona biomolecolare completa. Come tale, questo lavoro dimostra metodologie per caratterizzare sia i componenti proteici che quelli metaboliti della corona biomolecolare utilizzando approcci di proteomica e metabolomica bottom-up in parallelo. Ciò include un digest su particella della corona proteica con un tensioattivo utilizzato per aumentare il recupero proteico e una caratterizzazione passiva del metabolita corona analizzando le matrici di metaboliti prima e dopo le esposizioni NM. Questo lavoro introduce l'elettroforesi capillare – spettrometria di massa (CESI-MS) come nuova tecnica per la caratterizzazione della corona NM. I protocolli qui delineati dimostrano come CESI-MS possa essere utilizzato per la caratterizzazione affidabile sia della proteina che del metabolita corona acquisiti dalle RM. Il passaggio a CESI-MS riduce notevolmente il volume di campione richiesto (rispetto ai tradizionali approcci di cromatografia liquida – spettrometria di massa (LC-MS)) con iniezioni multiple possibili da un minimo di 5 μL di campione, rendendolo ideale per campioni a volume limitato. Inoltre, le conseguenze ambientali dell'analisi sono ridotte rispetto a LC-MS a causa delle basse portate (<20 nL/min) in CESI-MS e dell'uso di elettroliti acquosi che eliminano la necessità di solventi organici.

Il metodo descritto è il primo a caratterizzare sia le proteine che i metaboliti nella corona biomolecolare NM utilizzando lo stesso campione di plasma umano. Questo metodo è in grado di rilevare >200 proteine e metaboliti >150, consentendo così di determinare la panoramica più completa della corona biomolecolare completa, consentendo una migliore comprensione dell'attaccamento cellulare, dell'assorbimento e degli impatti delle RM.
L'uso di CESI-MS sia per la separazione e la rilevazione della proteomica (Figura 1) che per la metabolomica (Figura 2) mostra buone finestre di separazione su entrambi i capillari per ciascun approccio.
Questo metodo è in grado di distinguere tra le proteine nella corona in un'ampia gamma di composizioni di NN, dimostrando così l'applicabilità dei metodi alle NN in un'ampia gamma di caratteristiche fisiche e chimiche (Tabella 1).
Le impronte digitali uniche del metabolita corona possono anche essere distinte usando il ramo metabolomico di questa metodologia (Figura 3). Sebbene questo approccio utilizzi un approccio passivo per caratterizzare il metabolita NM corona, è ancora in grado di scoprire interessanti approfondimenti sul ruolo dei metaboliti nella corona biomolecolare come l'adsorbimento differenziale degli isomeri (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Figura 1: Elettroferogramma esemplare di una separazione corona della proteina SiO2 utilizzando CESI-MS a seguito di un digest su particella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Figura 2: Esempio di elettroferogrammi ionici estratti ottenuti da composti endogeni nel plasma da CE-MS. I composti numerato sono i seguenti: 1. Ornitina; 2. Lisina; 3. Arginina; 4. Istidina; 5. Creatina; 6. Glicina; 7. Alanina; 8. Valina; 9. Isoleucina; 10. Leucina; 11. Serina; 12. Treonina; 13. Asparagina; 14. Metionina; 15. Glutammina; 16. Acido glutammico; 17. Fenil-D5-alanina; 18. Fenilalanina; 19. Tirosina; 20. Prolina; 21. Metionina solfone (standard interno). Pubblicato sotto una licenza Creative Commons CC BY ad accesso aperto e riprodotto da Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Analisi della corona proteica in una serie di 6 NMs. Mappa termica delle classi proteiche identificate su silice (SiO2), titania (TiO2), titania ricoperta di PVP (TiO2-PVP), titania ricoperta di dispex (TiO2-Dispex), polistirene e polistirene CARBOSSILATO NMs. Le percentuali si riferiscono all'abbondanza delle proteine rispetto al contenuto proteico totale in base all'abbondanza dei primi 3 peptidi per ciascuna proteina. Date le differenze osservate nelle abbondanze relative di proteine nelle diverse corone NM, è chiaro che questo protocollo proposto è sufficientemente sensibile per distinguere tra la corona proteica di diversi NM. Figura riprodotta da un'analisi CESI-MS della corona proteica, pubblicata sotto una licenza Creative Commons CC BY ad accesso aperto11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Figura 3: Analisi mirata dei metaboliti cationici nella corona NM. Adsorbimento dei cationi a SiO2 e TiO2 NMs. Il rosso si riferisce alla concentrazione iniziale dei metaboliti mentre il blu si riferisce alla concentrazione di metaboliti dopo un'incubazione di 1 ora con i NN a 37 °C. La riduzione della concentrazione del metabolita nella soluzione è il risultato dell'adsorbimento del metabolita sulla superficie NM. Non è stato osservato alcun adsorbimento significativo dei metaboliti per i NN di polistirene. I box plot rappresentano i valori minimo e massimo, gli intervalli mediani e interquartili. Figura riprodotta da un'analisi mirata CESI-MS del metabolita corona pubblicata sotto una licenza Creative Commons CC BY ad accesso aperto15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Figura 4: Analisi mirata dei metaboliti anionici nella corona NM con particolare attenzione all'adsorbimento degli isomeri. L'adsorbimento degli anioni in una gamma di TITANIA NMs mostra chiare differenze tra vari isomeri come i fosfati di zucchero. Il rosso si riferisce alla concentrazione iniziale di metaboliti mentre il blu si riferisce alla concentrazione di metaboliti dopo un'incubazione di 1 ora con il NM a 37 °C. La riduzione della concentrazione del metabolita in soluzione è il risultato dell'adsorbimento del metabolita sulla superficie NM. Non è stato osservato alcun adsorbimento significativo dei metaboliti per il SiO2 e il polistirene NMs. I box plot rappresentano i valori minimo e massimo, gli intervalli mediani e interquartili. Figura riprodotta da un'analisi mirata CESI-MS del metabolita corona pubblicata sotto una licenza Creative Common CC BY ad accesso aperto15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analita</td>
			<td>Area media di picco RSD</td>
			<td>Tempo medio di migrazione RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 peptidi intraday (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cationi infragiogiosi (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cationi inter-giorno (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Riproducibilità delle repliche tecniche CESI-MS per peptidi e metaboliti cationici. RSD: deviazione standard relativa, come misura di riproducibilità. La riproducibilità del CESI-MS in termini di aree di picco e tempi di migrazione è molto buona, con tutti gli analiti che hanno un RSD medio <15% e i tempi di migrazione <2,2%. Questi risultati dimostrano l'elevato grado di confidenza che può essere attribuito ai dati raccolti utilizzando questa tecnica e confermano che le variazioni rilevate sono dovute a differenze reali nella composizione del campione (arricchimento su NN) piuttosto che alla variazione analitica. La Tabella 2 è generata dai risultati presentati in precedenza11,15.

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Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Qui presentiamo un protocollo per caratterizzare la corona biomolecolare completa, le proteine e i metaboliti, acquisiti dai nanomateriali dai biofluidi utilizzando un approccio di elettroforesi capillare – spettrometria di massa.

Approcci di spettrometria di massa per elettroforesi capillare per la caratterizzazione della proteina e del metabolita Corona acquisiti da nanomateriali

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-approaches-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

4.3K Views.  University of Birmingham. Qui presentiamo un protocollo per caratterizzare la corona biomolecolare completa, le proteine e i metaboliti, acquisiti dai nanomateriali dai biofluidi utilizzando un approccio di elettroforesi capillare – spettrometria di massa.

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Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

Analizzando la dinamica delle proteine ​​che utilizzano l&#39;idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Ricerca

Chimica

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Mass spettrometrica Approcci alla struttura studio e interazioni proteina in liofilizzati Polveri

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Usando elettroforesi capillare per quantificare Acidi organici da tessuti vegetali: un banco di prova d&#39;esame<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Semi

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Un saggio di HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità QTOF

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Analisi dell'espirato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria Nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Sintesi e analisi di spettrometria di massa di Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Analisi di architetture di proteine e complessi proteina-ligando mediante spettrometria di massa strutturale integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Proteomica di Top-down su larga scala usando la spettrometria totale in Tandem elettroforesi capillare zona

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Sorveglianza dei medicinali ad alta produttività e completa usando la spettrometria totale multisegmento elettroforesi di iniezione-capillare

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...