Este protocolo se puede utilizar para inactivar genes cromosómicos para aislar mutantes para el estudio de la función génica y bacterias. Hace que el proceso de recombinación homólogo sea simple, rápido y altamente eficiente. Usando esta técnica, los genes relacionados con la virulencia del patógeno se pueden eliminar para obtener el mutante atenuado que se puede utilizar como candidato para la vacuna atenuada.
Comience por amplificar el casete de cloranfenicol que contiene fragmentos de hemología del gen micC. Diseñar cebadores directos e inversos para amplificar el casete de cloranfenicol del plásmido PKD3, incluidas 50 extensiones de homología de pares de bases de los cinco extremos primos y tres primarios del gen micC. Realizar PCR como se describe en el texto manuscrito utilizando el plásmido PKD3 como plantilla para amplificar el casete de cloranfenicol.
Determine el tamaño del producto de PCR con electroforesis en gel de agarosa. Luego purifique el producto con un kit de recuperación de gel de ADN y determine la concentración de ADN por espectrofotometría. Llevar a cabo una segunda reacción de PCR para eliminar la interferencia de una mayor recombinación por el plásmido PKD3.
Diluir el primer producto de PCR en una proporción de 1 a 200 y utilizarlo como plantilla para la PCR secundaria. Para construir la primera cepa recombinante 50336 delta micC dot cat, mezcle 100 microlitros de células competentes SE 50336 con cinco microlitros de plásmido PKD 46 e incube en hielo durante 30 minutos. Golpee la mezcla a 42 grados centígrados durante 90 segundos y transfiérala rápidamente sobre hielo durante dos minutos para transformar el plásmido en las células.
Detectar colonias positivas cultivando las células durante la noche a 30 grados centígrados en una placa resistente a la ampicilina. Al día siguiente, agregue 30 mili más de L de arabinosa al cultivo líquido SE 50336 PKD 46 e induzca la expresión de recombinasa con una incubación de una hora a 30 grados centígrados mientras agita. Mezcle 100 nanogramos del producto de PCR purificado y 40 microlitros de células competentes SE 50336 PKD 46 en una taza de descarga eléctrica.
Luego lleva a cabo la transformación de descargas eléctricas. Después de la electrotransformación, transfiera la mezcla a un mililitro de medio SOC y una incubadora de cultivo de agitación a 150 RPM y 30 grados centígrados durante una hora. Extienda la mezcla en una placa LB resistente al cloranfenicol y cultive a 37 grados centígrados durante la noche para detectar colonias positivas.
Cultive las colonias positivas a 42 grados centígrados durante dos horas. Luego examine la colonia para detectar sensibilidad a la ampicilina y resistencia al cloranfenicol a 37 grados centígrados durante la noche para obtener la primera cepa recombinante sin PKD 46. Después de extraer el ADN genómico 50336 Delta micC dot cat mediante PCR y electroforesis en gel, electroplatee 100 nanogramos del plásmido PCP 20 en 40 microlitros de 50336 Delta micC dot cat competent cells.
Cribe transformadores positivos en placas resistentes a ampicilina y cloranfenicol a 30 grados centígrados. Transfiera los transformadores positivos a un medio líquido LB no resistente y pérelos durante la noche a 42 grados centígrados. Luego aísle colonias individuales en una placa LB a 37 grados centígrados.
Seleccione la colonia que sea sensible tanto a la ampicilina como al cloranfenicol. Este mutante es el mutante de deleción micC SE 50336 Delta micC. Verifique 50336 Delta micC realizando PCR como se describe en el texto manuscrito.
Este protocolo se utilizó para construir el mutante de deleción 50336 Delta micC en el mutante complementario 50336 Delta micC, pmicC. El primer gato 50336 Delta micC dot recombinante se validó mediante PCR con un tamaño de banda esperado de aproximadamente 1200 pares de bases de productos de PCR con la inserción de cloranfenicol en comparación con 279 pares de bases en la cepa de tipo salvaje. En la segunda recombinación, el casete de cloranfenicol fue eliminado por PCP 20.
Los resultados de la PCR combinados con la secuenciación confirmaron que el mutante isogénico micC se construyó con éxito. La expresión de los genes ompA, ompC y ompD en las cepas 50336, 50336 Delta micC y 50336 delta micC pmicC se analizaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. La transcripción de ompA y ompC y 50336 delta micC aumentó aproximadamente 2,2 veces y tres veces en comparación con la cepa de tipo salvaje.
Mientras que la transcripción de ompD solo aumentó ligeramente. Los ensayos LD 50 mostraron que después de infectar ratones BALB/c de seis a ocho semanas de edad con cada una de las tres cepas, la mayoría de los ratones infectados por 50336 Delta micC mostraron lasitud, inapetencia o diarrea 48 horas después de la infección y murieron después de 96 horas. Los ratones infectados por cepa de tipo salvaje y 50336 delta micC pmicC mostraron los mismos síntomas 72 horas después de la infección y murieron después de 120 horas.
Los LD 50 de las tres cepas indicaron que la virulencia del mutante 50336 Delta micC mejoró 2,5 veces en comparación con el tipo salvaje. Esta técnica ayuda a los investigadores a estudiar la función de los genes bacterianos y obtener la cepa de ingeniería deseada mediante la eliminación de genes objetivo.
