Los nucleósidos y nucleótidos son componentes metabólicos centrales en todos los organismos vivos. El metabolismo de ellos es necesario para el desarrollo celular. Este enfoque proporciona una poderosa herramienta para la cuantificación de estos metabolitos.
Este método permite la cuantificación rápida y precisa de nucleósidos y nucleótidos en plantas. Los pre-tratamientos completos de la muestra y los análisis lc-ms/ms toman cerca de dos días para un conjunto de 10 a 20 muestras. Este método se puede aplicar a todas las plantas e incluso a otros organismos.
Demostrando el procedimiento estará Changhua Zhu, profesor asociado del Laboratorio Chen. Para cultivar las plantas, asegúrese de que las semillas de Arabidopsis se esterilicen en etanol al 70% durante 10 minutos y se sembran en placas de agar con nutrientes Murashige y Skoog de 1/2 fuerza. Incubar las placas en la oscuridad a cuatro grados Celsius durante 48 horas, luego transferirlas a una cámara de crecimiento controlado bajo 16 horas de luz a 22 grados Celsius y ocho horas de oscuridad a 20 grados Celsius.
Cosechar 100 miligramos de plántulas de dos semanas y congelarlos en nitrógeno líquido para la extracción de metabolitos. Moler 100 miligramos de tejidos vegetales congelados con siete a ocho perlas de acero en un molino mezclador preenfriado durante cinco minutos a una frecuencia de 60 Hertz. Prepare la solución de extracción, que contiene metanol, acetonitrilo y agua en una proporción de dos a dos a uno.
Resuspend los materiales homogeneizados con un mililitro de la solución de extracción. Centrifugar la solución resultante a 12, 000 XG durante 15 minutos a cuatro grados Celsius, luego transferir 0.5 mililitros de la suspensión a un nuevo tubo de 1.5 mililitros y congelarlo en nitrógeno líquido. Evaporar la muestra congelada en un liofilizador y resuspend en 0,5 mililitros de acetonitrilo al 5% y 95% de agua.
Centrifugar la solución resultante a 4,000 XG durante 10 minutos a cuatro grados Centígrados. Cargue el sobrenadante en un vial para la medición de LC-MS/MS. Prepare un tampón de acetato de amonio de 10 milimolares disolviendo 1,5 gramos de acetato de amonio en dos litros de agua doblemente desionizada.
Ajuste el pH a 9,5 con ácido de amonio y acetato al 10%. Prepare dos litros de ultrapuro 100% metanol para la medición de nucleósidos, luego prepare dos litros de acetonitrilo ultrapuro para la medición de nucleótidos. Inyecte 0,02 mililitros de la extracción de metabolitos pretratados de cada muestra previamente preparada en un sistema de HPLC con bombas binarias junto con un espectrómetro de masas triple cuádruple.
Para generar las curvas de calibración estándar, aglutico las extracciones de seis muestras y vórtice la mezcla, luego alícuota a seis extracciones de nuevo para obtener cada fondo. Agregue seis concentraciones diferentes de cada estándar a estas seis extracciones respectivamente e inyéctelas una por una en el sistema de HPLC. Registre las áreas pico de cada estándar en diferentes concentraciones a través de las transiciones de masa.
Este protocolo fue utilizado para identificar y para cuantificar N1-methyladenosine, un nucleósido modificado sabido, en el salvaje-tipo dos-semana-viejos plántulas del Arabidopsis. El perfil de espectrometría de masas indicó que los iones del producto generados a partir del estándar N1-metiladenosina están en proporciones de 150 y 133 MZ. Y el mismo perfil se observó en la extracción cero de Colombia.
Debido a la alta abundancia del ion del producto de 150 MZ, la transición total de 282,1 a 150 fue seleccionada para la identificación de N1-methyladenosine. El tiempo de retención del pico objetivo fue de 7,05 minutos. Igual que el tiempo de retención de N1-metiladenosina estándar.
Una serie de la concentración de estándares de N1-methyladenosine fue agregada en seis extracciones de la muestra. Las muestras estándar fueron inyectadas en el LC-MS/MS y las áreas máximas crecientes de N1-methyladenosine fueron trazadas contra las concentraciones nominales de los estándares. Las seis extracciones de fondo iguales son importantes para hacer una curva de calibración precisa y repetible para la cuantificación.
Nuestro método se puede aplicar para explorar las vías metabólicas en las plantas. Mediante la comparación de los perfiles de metabolitos entre mutantes de tipo salvaje y pérdida de función, el flujo metabólico podría ser dibujado.
