Nucleosides e nucleotidi sono componenti metabolici centrali in tutti gli organismi viventi. Il loro metabolismo è necessario per lo sviluppo cellulare. Questo approccio fornisce un potente strumento per la quantificazione di questi metaboliti.
Questo metodo consente una quantificazione rapida e accurata di nucleosidi e nucleotidi nelle piante. I pre-trattamenti completi del campione e le analisi LC-MS/MS hanno una soluzione di circa due giorni per un set di 10-20 campioni. Questo metodo può essere applicato a tutte le piante e anche ad altri organismi.
A dimostrare la procedura sarà Changhua Zhu, professore associato del Laboratorio Chen. Per coltivare le piante, assicurarsi che i semi arabidopsis vengano sterilizzati in 70%etanolo per 10 minuti e seminati su piastre di agar con 1/2 forza di nutrienti Murashige e Skoog. Incubare le piastre al buio a quattro gradi Celsius per 48 ore, quindi trasferirle in una camera di crescita controllata sotto 16 ore di luce a 22 gradi Celsius e otto ore di buio a 20 gradi Celsius.
Raccogliere 100 milligrammi di piantine di due settimane e congelarle in azoto liquido per l'estrazione dei metaboliti. Macinare 100 milligrammi di tessuti vegetali congelati con da sette a otto perline di acciaio in un miscelatore preritolato per cinque minuti ad una frequenza di 60 Hertz. Preparare la soluzione di estrazione, che contiene metanolo, acetonitrile e acqua con un rapporto tra due e due a uno.
Rimostrare i materiali omogeneizzati con un millilitro della soluzione di estrazione. Centrifugare la soluzione risultante a 12.000 XG per 15 minuti a quattro gradi Celsius, quindi trasferire 0,5 millilitri della sospensione in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e congelarlo in azoto liquido. Evaporare il campione congelato in un essiccatore a congelatore e riprenosirlo in 0,5 millilitri di acetonitrile al 5% e 95% di acqua.
Centrifugare la soluzione risultante a 4.000 XG per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Caricare il supernatante in una fiala per la misurazione LC-MS/MS. Preparare un tampone di acetato di ammonio millimolare sciogliendo 1,5 grammi di acetato di ammonio in due litri di acqua doppia deionizzata.
Regolare il pH a 9,5 con il 10% di ammonio e acido acetato. Preparare due litri di ultrapuro 100%metanolo per la misurazione dei nucleosidi, quindi preparare due litri di acetonitrile ultrapuro per la misurazione dei nucleotidi. Iniettare 0,02 millilitri dell'estrazione di metaboliti pretrattati di ogni campione precedentemente preparato in un sistema HPLC con pompe binarie accoppiate con un triplo spettrometro di massa quadruplo.
Per generare le curve di calibrazione standard, raggruppare sei estrazioni di campioni insieme e vortice la miscela, quindi aliquotarla nuovamente a sei estrazioni per ottenere ogni sfondo. Aggiungere sei diverse concentrazioni di ogni standard rispettivamente a queste sei estrazioni e iniettarle una per una nel sistema HPLC. Registrare le aree di picco di ogni standard a diverse concentrazioni attraverso le transizioni di massa.
Questo protocollo è stato utilizzato per identificare e quantificare l'N1-metilladenosina, un nucleoside modificato noto, in piantine di tipo selvatico Arabidopsis vecchie di due settimane. Il profilo di spettrometria di massa indicava che gli ioni prodotto generati dallo standard N1-metilladenosina sono a rapporti 150 e 133 MZ. E lo stesso profilo è stato osservato nell'estrazione zero della Colombia.
A causa dell'elevata abbondanza dello ione prodotto di 150 MZ, la transizione di massa da 282,1 a 150 è stata selezionata per l'identificazione N1-metilladenosina. Il tempo di conservazione del picco di destinazione è stato di 7,05 minuti. Come il tempo di conservazione dello standard N1-metilladenosina.
Una serie di concentrazione di standard N1-metilladenosina è stata aggiunta in sei estrazioni di campioni. I campioni standard sono stati iniettati nella LC-MS/MS e le aree di picco aumentate della N1-metilladenosina sono state tracciate rispetto alle concentrazioni nominali delle norme. Le sei estrazioni di fondo uguali sono importanti per effettuare una curva di taratura accurata e ripetibile per la quantificazione.
Il nostro metodo può essere applicato per esplorare le vie metaboliche nelle piante. Confrontando i profili dei metaboliti tra mutanti di tipo selvatico e mutanti a perdita di funzione, si potrebbe disegnare il flusso metabolico.
