使用 HPLC-MS/MS 进行核苷/核苷酸含量测量的工厂样品制备

核苷酸和核苷酸是所有生物体中的核心代谢成分。细胞发育需要新陈代谢。这种方法为这些代谢物的定量提供了一个强大的工具。

这种方法允许快速和准确地量化植物中的核苷酸和核苷酸。完整的样品预处理和LC-MS/MS分析大约需要两天时间，一组10至20个样本。这种方法可以应用于所有植物，甚至其他生物体。

陈实验室副教授朱昌华将演示这个程序。要种植这些植物，请确保阿拉伯多维西斯种子在70%乙醇中灭菌10分钟，并在具有1/2强度的穆拉希格和斯库格营养物质的阿加板上播种。在4摄氏度的黑暗中孵化48小时，然后在22摄氏度的光线下将盘子转移到受控的生长室，在20摄氏度下将盘子转移到8小时的黑暗中。

收获100毫克两周幼苗，并冷冻在液氮中，用于代谢物提取。在预冷搅拌机磨坊中用 7 到 8 个钢珠研磨 100 毫克冷冻植物组织，每次 60 赫兹。准备提取溶液，其中含有甲醇，乙酮三酯和水的比例为2比2比1。

用提取溶液的一毫升来补充同质化材料。在 12，000 XG 下将产生的溶液在 4 摄氏度下进行 15 分钟，然后将 0.5 毫升悬浮液转移到新的 1.5 毫升管中，并将其冻结在液氮中。在冷冻烘干机中蒸发冷冻样品，然后以 0.5 毫升 5% 的甲基三甲基和 95% 的水将其补充。

在4000 XG下将产生的溶液离心10分钟，温度为4摄氏度。将超自然物加载到小瓶中，用于 LC-MS/MS 测量。准备一个10毫升醋酸铵缓冲器，在两升双阳离子水中溶解1.5克醋酸铵。

将pH到9.5调整为10%铵和醋酸。准备两升超纯100%甲醇进行核苷测量，然后准备两升超纯乙酰胺进行核苷酸测量。将先前准备的样品的预处理代谢物提取的 0.02 毫升注入 HPLC 系统，并配有二进制泵和三重四倍质谱仪。

要生成标准校准曲线，将六个样本萃取汇集在一起并漩涡混合物，然后将其重新引用到六个提取以获取每个背景。在这六个提取中分别添加六种不同浓度的每个标准，并逐一注入 HPLC 系统。通过质量转换以不同浓度记录每个标准的峰值区域。

该协议用于识别和量化N1-甲基二甲基诺辛，一种已知的改良核苷，在两个星期大的阿拉伯野生型幼苗。质谱剖面表明，N1-甲基二甲基诺辛标准产生的产品离子比例为150和133MZ。哥伦比亚零提取中也观察到了同样的轮廓。

由于150 MZ产品离子的丰度很高，因此选择282.1到150的质量过渡进行N1-甲基叶氨酸鉴定。目标峰值的保留时间为 7.05 分钟。与 N1-甲基甲基诺辛标准的保留时间相同。

在六次样品提取中加入了N1-甲基二甲基诺辛标准的浓度系列。标准样品被注射到LC-MS/MS中，并根据标准的名义浓度绘制了增加的N1-甲基甲基甲酸的峰值区域。六个相等的背景提取对于为量化制定准确且可重复的校准曲线非常重要。

我们的方法可以应用于探索植物的代谢途径。通过比较野生型突变体和功能丧失突变体之间的代谢物轮廓，可以绘制代谢通量。