Nükleozidler ve nükleotitler tüm canlı organizmalarda merkezi metabolik bileşenlerdir. Hücre gelişimi için metabolizmaları gereklidir. Bu yaklaşım, bu metabolitlerin nicelemesi için güçlü bir araç sağlar.
Bu yöntem, bitkilerdeki nükleozitlerin ve nükleotitlerin hızlı ve doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar. Tam numune ön tedavileri ve LC-MS/MS analizleri 10 ila 20 örnek seti için yaklaşık iki gün sürer. Bu yöntem tüm bitkilere ve hatta diğer organizmalara uygulanabilir.
Prosedürü gösteren Changhua Zhu, Chen Laboratuvarı'ndan doçent. Bitkileri yetiştirmek için, Arabidopsis tohumlarının 10 dakika boyunca% 70 etanolde sterilize olduğundan ve 1/2 mukavemetli Murashige ve Skoog besinleri ile agar plakalarına ekilmesini sağlayın. Plakaları 48 saat boyunca dört santigrat derecede karanlıkta kuluçkaya yatırın, ardından 22 santigrat derecede 16 saat ışığın altında ve 20 santigrat derecede sekiz saat karanlıkta kontrollü bir büyüme odasına aktarın.
İki haftalık fidelerin 100 miligramını hasat edin ve metabolit ekstraksiyonu için sıvı nitrojende dondurun. Önceden soğutulmuş bir mikser fabrikasında yedi ila sekiz çelik boncuk ile 100 miligram dondurulmuş bitki dokusunu 60 Hertz frekansında beş dakika boyunca öğütün. Metanol, asetonitril ve su içeren ekstraksiyon çözeltisini ikiye ikiye bir oranında hazırlayın.
Homojenize malzemeleri bir mililitre ekstraksiyon çözeltisi ile yeniden kullanın. Elde eden çözeltiyi 12.000 XG'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin, ardından süspansiyonun 0,5 mililitresini yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve sıvı nitrojende dondurun. Donmuş numuneyi bir dondurarak kurutucuda buharlaştırın ve %5 asetonitril ve %95 su ile 0,5 mililitre yeniden depolayın.
Elde ettiği çözeltiyi 4.000 XG'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. LC-MS/MS ölçümü için süpernatant bir şişeye yükleyin. İki litre çift deiyonize suda 1,5 gram amonyum asetat eriterek 10 milimoler amonyum asetat tampon hazırlayın.
PH'ı %10 amonyum ve asetat asit ile 9,5'e ayarlayın. Nükleozid ölçümü için iki litre ultra saf %100 metanol hazırlayın, ardından nükleotid ölçümü için iki litre ultra saf asetonitril hazırlayın. Daha önce hazırlanmış her numunenin önceden işlemden geçirilen metabolit ekstraksiyonunun 0,02 mililitresini, üçlü dörtlü kütle spektrometresi ile birleştirilmiş ikili pompalarla bir HPLC sistemine enjekte edin.
Standart kalibrasyon eğrilerini oluşturmak için, altı numune ekstraksiyonunu bir araya getirin ve karışımı girdaplayın, sonra her arka planı elde etmek için tekrar altı ekstraksiyona aliquot. Bu altı ekstraksiyona sırasıyla her standartın altı farklı konsantrasyonu ekleyin ve bunları HPLC sistemine tek tek enjekte edin. Kütle geçişleri yoluyla her standardın tepe alanlarını farklı konsantrasyonlarda kaydedin.
Bu protokol, iki haftalık Arabidopsis vahşi tip fidelerinde bilinen bir modifiye nükleozid olan N1-metildenozin'i tanımlamak ve ölçmek için kullanıldı. Kütle spektrometresi profili, N1-metildenozin standardından üretilen ürün iyonlarının 150 ve 133 MZ oranlarında olduğunu gösterdi. Kolombiya sıfır çıkarmada da aynı profil gözlendi.
150 MZ'lik ürün iyonunun yüksek bolluğu nedeniyle, N1-metildenozin tanımlaması için 282,1 ila 150 kütle geçişi seçildi. Hedef tepenin tutma süresi 7.05 dakikaydı. N1-metildenozin standardının tutma süresi ile aynıdır.
Altı numune ekstraksiyonuna bir konsantrasyon serisi N1-metildenozin standardı eklendi. Standart numuneler LC-MS/MS'e enjekte edildi ve N1-metiladenozinin artan pik alanları standartların nominal konsantrasyonlarına göre çizildi. Altı eşit arka plan ekstraksiyonu, nicelik için doğru ve tekrarlanabilir bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için önemlidir.
Yöntemimiz bitkilerdeki metabolik yolları keşfetmek için uygulanabilir. Metabolit profilleri vahşi tip ve fonksiyon kaybı mutantları arasında karşılaştırarak metabolik akı çizilebilir.
