Nucleosídeos e nucleotídeos são componentes metabólicos centrais em todos os organismos vivos. O metabolismo deles é necessário para o desenvolvimento celular. Esta abordagem fornece uma ferramenta poderosa para a quantificação desses metabólitos.
Este método permite quantificação rápida e precisa de nucleosídeos e nucleotídeos nas plantas. Os pré-tratamentos completos da amostra e as análises de LC-MS/MS levam cerca de dois dias para um conjunto de 10 a 20 amostras. Este método pode ser aplicado a todas as plantas e até mesmo a outros organismos.
Demonstrando o procedimento estará Changhua Zhu, professor associado do Laboratório de Chen. Para cultivar as plantas, certifique-se de que as sementes arabidopsis sejam esterilizadas em 70% de etanol por 10 minutos e semeadas em placas de ágar com 1/2 de resistência murashige e nutrientes Skoog. Incubar as placas no escuro a quatro graus Celsius por 48 horas, depois transferi-las para uma câmara de crescimento controlada sob 16 horas de luz a 22 graus Celsius e oito horas de escuridão a 20 graus Celsius.
Colher 100 miligramas de mudas de duas semanas e congelá-las em nitrogênio líquido para extração metabólito. Triture 100 miligramas de tecidos vegetais congelados com sete a oito contas de aço em um moinho de mistura pré-resfriado por cinco minutos em uma frequência de 60 Hertz. Prepare a solução de extração, que contém metanol, acetonitrilo e água em uma proporção de dois para dois para um.
Resuspense os materiais homogeneizados com um mililitro da solução de extração. Centrifugar a solução resultante a 12.000 XG por 15 minutos a quatro graus Celsius, em seguida, transferir 0,5 mililitros da suspensão para um novo tubo de 1,5 mililitro e congelá-lo em nitrogênio líquido. Evaporar a amostra congelada em um secador congelado e resuspensá-la em 0,5 mililitro de 5% de acetonitrilo e 95% de água.
Centrifugar a solução resultante a 4.000 XG por 10 minutos a quatro graus Celsius. Carregue o supernatante em um frasco para a medição LC-MS/MS. Prepare um tampão de acetato de amônio de 10 milimônios dissolvendo 1,5 gramas de acetato de amônio em dois litros de água desionizada dupla.
Ajuste o pH para 9,5 com 10% de amônio e ácido acetato. Prepare dois litros de ultrapure 100% metanol para medição de nucleosídeos e prepare dois litros de acetonitrilo ultrapura para medição de nucleotídeos. Injete 0,02 mililitros da extração metabólito pré-tratada de cada amostra previamente preparada em um sistema HPLC com bombas binárias acopladas a um espectrômetro de massa quádruplo triplo.
Para gerar as curvas de calibração padrão, acumule seis extrações de amostra juntas e o vórtice da mistura, em seguida, aliquot-lo para seis extrações novamente para obter cada fundo. Adicione seis concentrações diferentes de cada padrão a essas seis extrações, respectivamente, e injete-as uma a uma no sistema HPLC. Regisso das áreas de pico de cada padrão em diferentes concentrações através das transições em massa.
Este protocolo foi usado para identificar e quantificar n1-metiladenosina, um nucleosídeo modificado conhecido, em mudas de dois dias de idade arabidopsis tipo selvagem. O perfil de espectrometria de massa indicou que os íons do produto gerados a partir do padrão N1-metiladenosina estão em 150 e 133 MZ ratios. E o mesmo perfil foi observado na extração zero da Colômbia.
Devido à alta abundância do íon do produto de 150 MZ, foi selecionada a transição em massa de 282,1 para 150 para a identificação de N1-metiladenosina. O tempo de retenção do pico alvo foi de 7,05 minutos. O mesmo que o tempo de retenção do padrão N1-metiladenosina.
Uma série de concentrações de n1-metiladenosina foi adicionada em seis extrações amostrais. As amostras padrão foram injetadas no LC-MS/MS e as áreas de pico aumentadas de N1-metiladenosina foram traçadas contra as concentrações nominais das normas. As seis extrações de fundo iguais são importantes para fazer uma curva de calibração precisa e repetível para a quantificação.
Nosso método pode ser aplicado para explorar caminhos metabólicos em plantas. Comparando os perfis metabólitos entre mutantes do tipo selvagem e perda de função, o fluxo metabólico poderia ser desenhado.
