Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG; Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 a P. Tomsits y D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 y SFB1002 proyecto A13 a N. Voigt), Fundación Alemana de Investigación bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania (EXC 2067/1- 390729940 a N. Voigt), Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss y N. Voigt; 81Z0600206 a S. Kääb), la Fundación Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), la ERA-NET sobre Enfermedades Cardiovasculares (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss), la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss) y la Fundación Else-Kröner-Fresenius (EKFS 2016_A20 a N. Voigt). Los financiadores no tuvieron ningún papel en la preparación del manuscrito.

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por la Junta de Revisión de Animales de Baja Sajonia (LAVES, AZ-18/2900) y se llevaron a cabo de acuerdo con todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar animal.
1. Preacuerdos
<ol><li>Preparar 1 L de tampón de perfusión 10x (Tabla 1), 500 ml de 1x tampón de perfusión (Tabla 2), 50 ml de tampón de digestión (Tabla 3), 10 ml de tampón de parada (Tabla 4), 1 L de solución de Tyrode (Tabla 5), 10 ml de cada solución escalonada de calcio (solución de Tyrode con glucosa y la cantidad respectiva de calcio según se indique), 1 L de solución de 4-AP (Tabla 5), 100 ml de solución de pipeta (Tabla 6) y 5 ml de ácido plurónico según las recetas proporcionadas. NOTA: Las soluciones de baño (Tyrode y solución 4-AP) se pueden preparar (sin glucosa) por adelantado y almacenar a +4 °C, la glucosa se agrega el día experimental. La solución de pipeta se puede almacenar a -20 °C, el indicador de calcio se añade el día experimental y la solución se almacena en hielo hasta su uso posterior. El tampón de perfusión 10x se puede almacenar a temperatura ambiente, el tampón de perfusión 1x, el tampón de digestión y el tampón de parada deben prepararse recién en el día experimental.</li>
	<li>Encienda el baño de agua y la bomba de rodillos.</li>
	<li>Prellenar el aparato de Langendorff con tampón de perfusión; Asegúrese de que esté libre de aire.</li>
	<li>Prepare la cánula aórtica fijándola bajo el microscopio de disección, conéctela con una jeringa de 1 ml llena de tampón de perfusión y limpie el aire enjuagando la cánula. NOTA: Es crucial evitar cualquier aire dentro del sistema de perfusión, ya que esto afectará directamente la perfusión coronaria y, por lo tanto, la efectividad de la digestión. Se puede agregar una trampa de burbujas a la configuración si es necesario, para evitar de manera segura cualquier atrapamiento de aire.</li>
	<li>Prepare placas de Petri con suficiente tampón de perfusión para la recolección de órganos y microscopía (el tampón debe cubrir de forma segura todo el órgano, unos pocos mililitros, dependiendo del tamaño de la placa de Petri utilizado, deberían ser suficientes).</li>
	<li>Prepare 3 placas de Petri con tampón de digestión para disociación de tejidos y microscopía, el tampón debe cubrir el órgano para la disección bajo el microscopio dentro de la placa de Petri respectiva, la cantidad depende del tamaño de la placa de Petri utilizada. Para la disociación use 3 mL para el tejido ventricular y 1.5 mL para el tejido auricular.</li>
</ol>2. Sustracción de órganos
<ol><li>Inyecte al ratón con 0,1 ml de heparina (1.000 U/ml) i.p. usando una jeringa de 1 ml con una cánula de 27 G y espere de 5 a 10 min.</li>
	<li>Coloque el ratón en una cámara de inducción junto con un pequeño tejido empapado en aproximadamente 500 μL de isoflurano. El animal no debe estar en contacto con el tejido. Para evitar eso, uno puede usar un casete de incrustación de biopsia plástica para cubrir el tejido. Una vez que el animal esté completamente anestesiado, verifique el reflejo de pellizco del dedo del pie y tan pronto como ya no esté presente, eutanasia rápidamente al ratón por dislocación cervical.</li>
	<li>Coloque el ratón en una plataforma sobre su espalda (por ejemplo, sobre espuma de poliestireno cubierta con una toalla de papel) y fije las patas hacia abajo con cánulas para mantenerlo en su lugar.</li>
	<li>Retire el pelaje y la piel que cubren el pecho y parte del abdomen con un corte claro desde el yugulo hacia la sínfisis y abra el abdomen justo debajo del xifoide sin dañar ninguna estructura de órgano con tijeras. Levante el esternón con fórceps quirúrgicos y corte el diafragma con tijeras a lo largo del borde de las costillas, luego corte las costillas en línea axilar medial y retire la caja torácica para exponer el corazón.</li>
	<li>Retire con cuidado el pericardio con pinzas romas y retire rápidamente el corazón levantándolo con pinzas romas desde abajo y cortando los vasos grandes con un solo corte con tijeras.</li>
	<li>Coloque el corazón en tampón de perfusión a temperatura ambiente y canule la aorta con una aguja roma bajo el microscopio lo más rápido posible. NOTA: Retire cualquier tejido pulmonar y tejido graso adherido al órgano sin perder demasiado tiempo en él. Mientras canula, asegúrese de que el extremo de la aguja no se extienda a través de la válvula aórtica, ya que esto perjudicará los resultados al evitar que los amortiguadores entren en las arterias coronarias.</li>
	<li>Ate el corazón con un trozo de seda de sutura firmemente a la aguja y desconéctelo de la jeringa. NOTA: Todo el procedimiento desde la obtención del corazón (el momento en que se cortan los vasos grandes) hasta la sutura de la aorta a la aguja debe tomar el menor tiempo posible. Se recomienda no tomar más de 90-180 s desde la extracción del corazón hasta el inicio de la perfusión.</li>
</ol>3. Digestión enzimática
<ol><li>Después de la canulación aórtica, conecte inmediatamente el corazón canulado al aparato de Langendorff evitando que entre aire en el sistema. NOTA: Puede ser útil tener una gota colgante de tampón de perfusión en la parte inferior del aparato de Langendorff, así como una gota de tampón de perfusión en la parte superior de la aguja para evitar que entre aire en el sistema.</li>
	<li>Perfundir el corazón con tampón de perfusión durante 1 min a una temperatura de exactamente 37 °C y una velocidad de perfusión de exactamente 4 mL/min. NOTA: Para tener una temperatura de 37 °C en la punta de la aguja de perfusión, la temperatura del baño de agua debe ajustarse ligeramente por encima de aproximadamente 40 °C. Esto debe probarse regularmente midiendo la temperatura en la punta de perfusión.</li>
	<li>Cambie la perfusión a tampón de digestión y perfunda durante exactamente 9 minutos a una temperatura de exactamente 37 °C y una velocidad de perfusión de exactamente 4 ml / min.</li>
	<li>Transfiera el corazón digerido a una placa de Petri con suficiente tampón de digestión para mantenerlo completamente cubierto. Luego disecciona cuidadosamente las aurículas y los ventrículos bajo el microscopio.</li>
	<li>Transfiera las aurículas a una placa de Petri con 1,5 ml de tampón de digestión y los ventrículos a otra placa de Petri con 3 ml de tampón de digestión.</li>
	<li>Disección auricular<ol><li>Con cuidado, pero sin pérdida de tiempo, separe las aurículas en pedazos pequeños con pinzas romas.</li>
		<li>Disuelva el tejido pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 1.000 μL, que se ha cortado previamente para ensanchar la abertura de la punta.</li>
		<li>Transfiera la solución a un tubo de centrífuga de 15 ml y agregue una cantidad equivalente de tampón de parada (1,5 ml) pipeteando cuidadosamente hacia abajo en el lado del tubo para finalizar la reacción.</li>
		<li>Pase cuidadosamente los 3 ml de soluciones celulares/tisulares a través de una malla de nylon de 200 μm para eliminar los trozos de tejido más grandes restantes que no se hayan digerido completamente. NOTA: Una digestión exitosa no dejará casi trozos sólidos.</li>
	</ol></li>
	<li>Disección ventricular<ol><li>Pique rápidamente el tejido ventricular en trozos pequeños con tijeras de disección y pipeta hacia arriba y hacia abajo para disolver. Utilice otra punta de pipeta de 1.000 μL para pipetear hacia arriba y hacia abajo, puede acortarse para ensanchar la abertura.</li>
		<li>Transfiera la solución celular/tisular a un tubo de centrífuga de 15 ml y agregue una cantidad equivalente de tampón de parada (3 ml) pipeteando cuidadosamente hacia abajo en el lado del tubo para finalizar la reacción.</li>
		<li>Pase cuidadosamente los 6 ml de solución celular/tisular a través de una malla de nylon de 200 μm para eliminar los trozos de tejido más grandes que no se hayan digerido completamente. NOTA: Una digestión exitosa no dejará casi trozos sólidos.</li>
	</ol></li>
	<li>Deje ambos tubos (suspensión de células auriculares y ventriculares) en el banco a temperatura ambiente durante 6 minutos para que se asienten.</li>
	<li>Centrifugar ambos tubos de 15 ml a 5 x g durante 2 min.</li>
</ol>4. Reintroducción del calcio
NOTA: Los siguientes pasos son idénticos para las células auriculares y ventriculares (a menos que se indique lo contrario) y se realizan a temperatura ambiente.
<ol><li>Deseche el sobrenadante con una pipeta plástica Pasteur y resuspenda cuidadosamente el pellet en 10 ml de solución Tyrode sin calcio.</li>
	<li>Deje las celdas durante 8 minutos para la sedimentación.</li>
	<li>Centrifugar a 5 x g durante 1 min (solo células auriculares, la sedimentación es suficiente para las células ventriculares).</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cuidadosamente el pellet en 10 ml de solución de Tyrode con una concentración de calcio de 100 μM.</li>
	<li>Deje las celdas durante 8 minutos para la sedimentación.</li>
	<li>Centrifugar a 5 x g durante 1 min (solo células auriculares, la sedimentación es suficiente para las células ventriculares).</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cuidadosamente el pellet en 10 ml de solución de Tyrode con una concentración de calcio de 400 μM.</li>
	<li>Deje las celdas durante 8 minutos para la sedimentación.</li>
	<li>Centrifugar a 5 x g durante 1 min (solo células auriculares, la sedimentación es suficiente para las células ventriculares).</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspenda cuidadosamente el pellet en 1 ml (auricular) / 5 ml (ventricular) de solución Tyrode con una concentración de calcio de 1 mM.</li>
</ol>5. Carga de miocitos con indicador de calcio fluorescente Fluo-3 AM
NOTA: Debido a la sensibilidad a la luz del indicador de calcio fluorescente, los siguientes pasos deben ejecutarse protegidos de la luz (por ejemplo, cubriendo los tubos con papel de aluminio).
<ol><li>Preparar la solución madre de Fluo-3 AM añadiendo 44 μL de plurónico F-127 al 20% en DMSO anhidro a 50 μg de Fluo-3AM (puede conservarse a -20 °C protegido de la luz).</li>
	<li>Añadir 10 μL de solución madre de Fluo-3 AM a 1 ml de suspensión celular e incubar durante 10 min a temperatura ambiente protegido de la luz.</li>
	<li>Centrifugar a 5 x g durante 1 min.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante con una pipeta plástica Pasteur y vuelva a suspender el pellet en una cantidad razonable de solución de baño para obtener una buena concentración de trabajo (1-5 ml de solución de baño dependiendo de la densidad celular).</li>
	<li>Dejar actuar durante 30 minutos para la desesterificación antes de comenzar con los experimentos.</li>
</ol>6. Mediciones simultáneas de patch-clamp y Ca2+-transitorio epifluorescente como se describió anteriormente16
NOTA: Las mediciones de pinzas de parche no son el tema de este artículo, el lector interesado puede ser referido a las principales publicaciones que proporcionan descripciones detalladas de este método 17,18,19,20,21,22. Sin embargo, para una mejor comprensión general, se proporciona un resumen de un protocolo para medir las corrientes de calcio de tipo L junto con los transitorios de calcio inducidos por corriente.
<ol><li>Transfiera los miocitos a una cámara celular y superfunda con una solución de baño a 37 °C.</li>
	<li>Bloquear las corrientes de potasio añadiendo 4-aminopiridina y cloruro de bario a la solución de baño como se indica en la Tabla 5.</li>
	<li>Asegúrese de que los microelectrodos de borosilicato tengan una resistencia de punta de 2-5 MΩ llena con solución de pipeta (Tabla 6).</li>
	<li>Configure las mediciones para permitir el registro simultáneo de señales eléctricas y epifluorescencia al mismo tiempo. El modo de abrazadera de voltaje se utiliza para medir la corriente Ca2+ de tipo L con un protocolo que mantiene la celda a -80 mV y un pulso de rampa de 600 ms a -40 mV para inactivar la corriente rápida de Na+, seguido de un pulso de prueba de 100 ms a +10 mV a 0.5 Hz (Figura 2).</li>
	<li>Utilice la excitación a 488 nm, emita luz a <520 nm para detectar y convertir a [Ca2+]I suponiendo <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61964/61964equ01.jpg"> Donde kd = constante de disociación de Fluo-3 (864 nM), F = fluorescencia de Fluo-3; Fmax = Ca2+-fluorescencia saturada obtenida al final de cada experimento19.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Camm, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation:+the+Task+force+for+the+management+of+atrial+fibrillation+of+the+European+Society+of+Cardiology+(ESC).">Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).</li><li>Chugh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+epidemiology+of+atrial+fibrillation:+a+global+burden+of+disease+2010+study.">Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study.</a> Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).</li><li>Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+whom+the+bell+tolls+:+Refining+risk+assessment+for+sudden+cardiac+death.">For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death.</a> Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).</li><li>Kirchhof, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2016+ESC+Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation+developed+in+collaboration+with+EACTS.">2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS.</a> European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).</li><li>Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiarrhythmic+drugs+for+treatment+of+atrial+fibrillation.">New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation.</a> Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).</li><li>Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes.">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).</li><li>Zimmerman, A. N., H&#252;lsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart.">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).</li><li>Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=With+or+without+Langendorff:+A+new+method+for+adult+myocyte+isolation+to+be+tested+with+time.">With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time.</a> Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).</li><li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution,+contraction,+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts.">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).</li><li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart.">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li><li>Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+optical+action+potential+measurement+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).</li></ol>

Este artículo proporciona una manera fácil y funcional de obtener miocitos auriculares y ventriculares de alta calidad del mismo ratón para estudios de parche y pinza con registros transitorios de calcio simultáneos. La calidad de los datos obtenidos depende en gran medida de la calidad del aislamiento celular. Como se mencionó anteriormente, muchos métodos para aislar cardiomiocitos murinos han sido descritos previamente 9,10,11,12.<sup class="x...

Las arritmias cardíacas son comunes y uno de los principales desafíos actuales de atención médica, ya que afectan a millones de personas en todo el mundo. Las arritmias se asocian con alta morbilidad y mortalidad 1,2 y representan la causa subyacente de la mayoría de las muertes súbitas cardíacas3. Las opciones de tratamiento actualizadas han mejorado la supervivencia del paciente, pero siguen siendo principalmente tratamientos sintomáticos en lugar de dirigirse a los mecanismos subyacentes. Por lo tanto, estos tratamientos tienen una eficacia limitada y con frecuencia pueden causar efectos secundarios graves 4,5,6. Una mejora de las opciones de tratamiento actuales requiere una visión de la fisiopatología subyacente, creando la necesidad de modelos adecuados para estudiar. Los modelos de animales pequeños, y específicamente los modelos de ratón, desempeñan un papel crucial en la investigación de arritmias, ya que permiten estudiar mecanismos clave de la arritmogénesis, por ejemplo, el impacto genético en la electrofisiología celular, la función del canal iónico o el manejo del calcio 7,8.
Para ello, se requieren cardiomiocitos auriculares y ventriculares aislados de cantidad y viabilidad suficientes. Se ha descrito previamente un amplio espectro de diferentes enfoques de aislamiento para obtener miocitos auriculares y ventriculares 9,10,11,12,13 y algunos grupos han presentado datos de mediciones simultáneas de corrientes de tipo L y transitorios de calcio inducidos por corriente de calcio de atrial 14 o ventricular 15 Cardiomiocitos murinos. Sin embargo, hasta donde sabemos, no hay datos disponibles de mediciones auriculares y ventriculares de un animal. Los investigadores se centran en una amplia variedad de temas que van desde la electrofisiología hasta la proteómica, estudios funcionales como la contractilidad celular o las interacciones de proteínas, la función mitocondrial o la genética, todos con necesidad de cardiomiocitos aislados. Por lo tanto, muchos de los protocolos publicados no se han desarrollado específicamente para estudios de pinza de parche, lo que lleva a rendimientos limitados y calidad celular insuficiente para estudios de pinza de parche. Por lo tanto, las mediciones simultáneas de pinza de parche y transitorios de calcio de células auriculares y ventriculares aisladas de un animal no se pueden realizar con los protocolos establecidos.
El aislamiento de miocitos murinos, especialmente auriculares, para experimentos de pinza de parche sigue siendo un desafío. Este artículo proporciona un método simple y rápido para el aislamiento de miocitos aurinos y ventriculares murinos de alta calidad a través de la perfusión de Langendorff basada en enzimas retrógradas, que posteriormente permite mediciones simultáneas de la corriente neta de la membrana y los transitorios de calcio inducidos por la corriente de un animal. Este artículo elabora un protocolo para el aislamiento de miocitos auriculares y ventriculares derivados de ratones de tipo salvaje y ratones portadores de mutaciones genéticas. Este protocolo se puede utilizar para ratones machos y hembras por igual. El aislamiento de miocitos, las imágenes y los resultados representativos que se describen a continuación se obtuvieron de ratones salvajes tipo C57Bl / 6 a la edad de 6 (± 1) meses. Sin embargo, este protocolo se ha utilizado con éxito en ratones de varias edades que van de 2 a 24 meses con diferentes genotipos. La figura 1 muestra la configuración de aislamiento y un primer plano de un corazón canulado durante la perfusión enzimática.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G cannula</td>
			<td>Servoprax</td>
			<td>L10220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A78403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic cannula</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130163-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt surgical forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650915-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12133C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating heated water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>ME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS994177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disscetion scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS600124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-aspartat K+-salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F3715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate tris salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating coil</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>25.000 IE/5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>induction chamber</td>
			<td>CWE incorporated</td>
			<td>13-40020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jacketed heart chamber</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049360250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl x 6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh (200 &#181;m)</td>
			<td>VWR-Germany</td>
			<td>510-9527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pasteur pipette</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z331759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri-dishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic Acid F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM597D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650908-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS700540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suturing silk</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NC9416241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z683531-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>86330</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of high quality murine atrial and ventricular myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and l-type calcium current

Los modelos de ratón desempeñan un papel crucial en la investigación de la arritmia y permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis, incluida la función alterada del canal iónico y el manejo del calcio. Para este propósito, los cardiomiocitos auriculares o ventriculares de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de patch-clamp o para explorar anomalías en el manejo del calcio. Sin embargo, el rendimiento limitado de cardiomiocitos de alta calidad obtenidos por los protocolos de aislamiento actuales no permite ambas mediciones en el mismo ratón. Este artículo describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares murinos de alta calidad mediante perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, para mediciones simultáneas posteriores de transitorios de calcio y corriente de calcio tipo L de un animal. Se obtienen corazones de ratón y la aorta se canula rápidamente para eliminar la sangre. Los corazones se perfunden inicialmente con una solución libre de calcio (37 °C) para disociar el tejido a nivel de discos intercalados y luego con una solución enzimática que contiene poco calcio para alterar la matriz extracelular (37 °C). El corazón digerido se disecciona posteriormente en aurículas y ventrículos. Las muestras de tejido se cortan en trozos pequeños y se disuelven pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo. La digestión enzimática se detiene, y las células se reintroducen gradualmente a las concentraciones fisiológicas de calcio. Después de cargar con un indicador fluorescente de Ca2+, los cardiomiocitos aislados se preparan para la medición simultánea de corrientes y transitorios de calcio. Además, se discuten las trampas de aislamiento y se proporcionan protocolos de patch-clamp y trazas representativas de corrientes de calcio tipo L con mediciones transitorias simultáneas de calcio en miocitos murinos auriculares y ventriculares aislados como se describió anteriormente.

El rendimiento de aislamiento se determina después de la reintroducción de calcio mediante el pipeteo de 10 μL de suspensión celular en un portaobjetos de microscopio. Más de 100 células viables, en forma de bastón, no contraídas/10 μL para el aislamiento de células auriculares y más de 1.000 células viables, en forma de bastón, no contraídas/10 μL para el aislamiento de células ventriculares se consideran rendimiento suficiente y se obtienen comúnmente utilizando este protocolo. Las células auriculares...

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Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.

Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

isolation-high-quality-murine-atrial-ventricular-myocytes-for

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

2.9K vistas.  Ludwig-Maximilians University Munich (LMU). Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.

Video: Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

El aislamiento y la manipulación genética de los miocitos cardiacos adultos de microscopía confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Investigación

Biología

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Aislamiento y grabaciones Kv Canal murinos en miocitos auriculares y ventriculares

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

El aislamiento de miocitos auriculares humanos para la medición simultánea de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitorios y corrientes de membrana

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Las mediciones del calcio citosólico en las células epiteliales renales mediante citometría de flujo

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tensión y calcio Dual Channel Mapping óptico de Cultivadas HL-1 auricular miocitos monocapa

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Desarrollo y caracterización de<em&gt; In Vitro</em&gt; Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Y la producción de óxido nítrico

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

Aislamiento simultáneo de cardiomiocitos de alta calidad, células endoteliales y fibroblastos de un corazón de rata adulto

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

Seguimiento de la liberación de calcio ER / SR con el Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor de Captura<supUnesdoc.unesco.org unesdoc.unesco.org</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...