이 연구는 독일 연구 재단 (DFG; 혈관 의학의 임상의 과학자 프로그램(PRIME), MA 2186/14-1 to P. Tomsits 및 D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 및 SFB1002 프로젝트 A13 to N. Voigt), 독일 우수 전략(Excellence Strategy)에 따른 독일 연구 재단(EXC 2067/1- 390729940 to N. Voigt), 독일 심혈관 연구 센터(German Centre for Cardiovascular Research, DZHK; 81X2600255 to S. Clauss and N. Voigt; 81Z0600206 to S. Kääb), 코로나 재단(Corona Foundation) (S199/10079/2019 to S. Clauss), 심혈관 질환에 관한 ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910 to S. Clauss), Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Clauss에게) 및 Else-Kröner-Fresenius 재단 (EKFS 2016_A20에서 N. Voigt까지). 자금 제공자는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

모든 동물 절차는 니더작센 동물 검토 위원회(LAVES, AZ-18/2900)의 승인을 받았으며 동물 복지에 대한 모든 제도적, 국가적 및 국제 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 사전 준비
<ol><li>1L의 10x 관류 완충액(표 1), 500mL의 1x 관류 완충액(표 2), 50mL의 소화 완충액(표 3), 10mL의 정지 완충액(표 4), 1L의 Tyrode 용액(표 5), 10mL의 각 칼슘 단계 용액(포도당 및 표시된 각 양의 칼슘을 포함하는 Tyrode 용액)을 준비하고, 제공된 레시피에 따라 1L의 4-AP 용액(표 5), 100mL의 피펫 용액(표 6) 및 5mL의 플루론산. 참고: 목욕 용액(Tyrode 및 4-AP 용액)은 미리 준비하여(포도당 없이) +4°C에서 보관할 수 있으며 실험 당일에 포도당을 첨가합니다. 피펫 용액은 -20°C에서 보관할 수 있으며, 칼슘 지시약은 실험 당일에 첨가하고, 용액은 그 후 추가 사용 시까지 얼음 위에 보관한다. 10x 관류 완충액은 실온에서 보관할 수 있으며, 1x 관류 완충액, 소화 완충액 및 정지 완충액은 실험 당일에 새로 준비해야 합니다.</li>
	<li>수조와 롤러 펌프를 켭니다.</li>
	<li>Langendorff 장치를 관류 완충액으로 미리 채우십시오. 공기가 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>대동맥 캐뉼라를 해부 현미경으로 고정하여 준비하고 관류 완충액으로 채워진 1mL 주사기에 연결하고 캐뉼라를 헹구어 공기를 맑게 합니다. 알림: 관류 시스템 내부의 공기는 관상 동맥 관류에 직접적인 영향을 미치므로 소화 효과에 직접적인 영향을 미치므로 피하는 것이 중요합니다. 공기 트래핑을 안전하게 방지하기 위해 필요한 경우 설정에 버블 트랩을 추가할 수 있습니다.</li>
	<li>장기 수집 및 현미경 검사를 위한 충분한 관류 완충액으로 페트리 접시를 준비합니다(완충액은 전체 장기를 단단히 덮어야 하며 사용된 페트리 접시 크기에 따라 몇 밀리리터이면 충분해야 함).</li>
	<li>조직 해리 및 현미경 검사를 위한 소화 완충액이 있는 3개의 페트리 접시를 준비하고, 완충액은 각 페트리 접시 내에서 현미경으로 해부할 장기를 덮어야 하며, 양은 사용된 페트리 접시 크기에 따라 다릅니다. 해리를 위해 심실 조직의 경우 3mL, 심방 조직의 경우 1.5mL를 사용합니다.</li>
</ol>2. 장기 적출
<ol><li>27G 캐뉼라가 있는 1mL 주사기를 사용하여 0.1mL의 헤파린(1,000U/mL) i.p.를 마우스에 주입하고 5-10분 동안 기다립니다.</li>
	<li>마우스를 약 500μL의 이소플루란에 담근 작은 조직과 함께 유도 챔버에 넣습니다. 동물은 조직과 접촉해서는 안됩니다. 이를 피하기 위해 플라스틱 생검 내장 카세트를 사용하여 조직을 덮을 수 있습니다. 동물이 완전히 마취되면 발가락 꼬집음 반사를 확인하고 더 이상 존재하지 않는 즉시 자궁 경부 탈구로 마우스를 신속하게 안락사시킵니다.</li>
	<li>마우스를 뒤쪽의 플랫폼(예: 종이 타월로 덮인 스티로폼 위)에 놓고 캐뉼라로 발을 고정하여 제자리에 고정합니다.</li>
	<li>가슴과 복부의 일부를 덮고있는 모피와 피부를 제거하고 jugulum에서 symphysis쪽으로 명확한 절개로 제거하고 가위를 사용하여 장기 구조를 손상시키지 않고 xiphoid 바로 아래에서 복부를 엽니 다. 수술용 집게로 흉골을 들어 올리고 갈비뼈 가장자리를 따라 가위로 횡격막을 자른 다음 내측 겨드랑이 라인에서 갈비뼈를 자르고 흉곽을 제거하여 심장을 노출시킵니다.</li>
	<li>뭉툭한 집게를 사용하여 심낭을 조심스럽게 제거하고 아래에서 뭉툭한 집게로 들어 올리고 가위를 사용하여 한 번의 절단으로 큰 혈관을 절단하여 심장을 빠르게 제거합니다.</li>
	<li>심장을 실온 관류 완충액에 넣고 현미경으로 뭉툭한 끝 바늘로 대동맥을 가능한 한 빨리 캐뉼러냅니다. 알림: 장기에 부착된 폐 조직과 지방 조직을 너무 많은 시간을 낭비하지 않고 제거하십시오. 캐뉼러를 삽입하는 동안 바늘 끝이 대동맥 판막을 통해 확장되지 않도록 하면 완충액이 관상 동맥으로 들어가는 것을 방지하여 결과를 손상시킬 수 있습니다.</li>
	<li>봉합 실크 조각으로 심장을 바늘에 단단히 묶고 주사기에서 분리하십시오. 참고: 심장을 채취하는 것(큰 혈관이 절단되는 순간)부터 대동맥을 바늘에 봉합할 때까지의 전체 절차는 가능한 한 적은 시간이 소요됩니다. 관류가 시작될 때까지 심장을 제거하는 데 90-180초 이상 걸리지 않는 것이 좋습니다.</li>
</ol>3. 효소 소화
<ol><li>대동맥 캐뉼라 삽입 후, 캐뉼러 된 심장을 즉시 Langendorff 장치에 연결하여 공기가 시스템에 유입되지 않도록하십시오. 알림: Langendorff 장치 하단에 관류 완충액 한 방울을 매달고 바늘 상단에 관류 완충액 한 방울을 놓아 시스템에 공기가 유입되는 것을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.</li>
	<li>정확히 37°C의 온도와 정확히 4mL/분의 관류 속도에서 1분 동안 관류 완충액으로 심장을 관류합니다. 참고: 관류 바늘 끝의 온도가 37°C가 되려면 수조 온도를 약 40°C보다 약간 높게 설정해야 합니다. 이것은 관류 팁의 온도를 측정하여 정기적으로 테스트해야 합니다.</li>
	<li>정확히 37°C의 온도와 정확히 4mL/분의 관류 속도에서 정확히 9분 동안 관류를 소화 완충액으로 전환합니다.</li>
	<li>소화된 심장을 완전히 덮을 수 있도록 충분한 소화 완충액이 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 현미경으로 심방과 심실을 조심스럽게 해부하십시오.</li>
	<li>심방을 1.5mL의 소화 완충액이 있는 페트리 접시에 옮기고 심실을 3mL의 소화 완충액이 있는 다른 페트리 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>심방 박리<ol><li>조심스럽게, 그러나 시간을 낭비하지 않고, 뭉툭한 집게를 사용하여 심방을 작은 조각으로 떼어 내십시오.</li>
		<li>팁 입구를 넓히기 위해 이전에 절단한 1,000μL 피펫 팁을 사용하여 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 조직을 용해합니다.</li>
		<li>용액을 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브 측면에서 조심스럽게 피펫팅하여 동일한 양의 정지 완충액(1.5mL)을 추가하여 반응을 종료합니다.</li>
		<li>3mL의 세포/조직 용액을 모두 200μm 나일론 메쉬에 조심스럽게 통과시켜 완전히 소화되지 않은 나머지 더 큰 조직 조각을 제거합니다. 알림: 소화가 성공하면 단단한 덩어리가 거의 남지 않습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>심실 박리<ol><li>해부 가위와 피펫을 위아래로 사용하여 심실 조직을 작은 조각으로 빠르게 잘라 용해시킵니다. 위아래로 피펫팅을 위해 다른 1,000μL 피펫 팁을 사용하고, 개구부를 넓히기 위해 단축할 수 있습니다.</li>
		<li>세포/조직 용액을 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브 측면에서 조심스럽게 피펫팅하여 동일한 양의 정지 완충액(3mL)을 추가하여 반응을 종료합니다.</li>
		<li>6mL의 모든 세포/조직 용액을 200μm 나일론 메쉬에 조심스럽게 통과시켜 완전히 소화되지 않은 더 큰 조직 조각을 제거합니다. 알림: 소화가 성공하면 단단한 덩어리가 거의 남지 않습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>두 튜브(심방 및 심실 세포 현탁액)를 실온에서 6분 동안 벤치에 두어 안정시킵니다.</li>
	<li>두 15mL 튜브를 5 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.</li>
</ol>4. 칼슘 재도입
참고: 다음 단계는 심방 및 심실 세포 모두에 대해 동일하며(달리 언급되지 않는 한) 실온에서 수행됩니다.
<ol><li>플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 칼슘이 없는 티로드 용액 10mL에 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.</li>
	<li>침전을 위해 세포를 8분 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>5 x g 에서 1 분 동안 원심 분리합니다 (심방 세포 만, 심실 세포에는 침전으로 충분합니다).</li>
	<li>상층액을 버리고 100μM 칼슘 농도의 Tyrode 용액 10mL에 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.</li>
	<li>침전을 위해 세포를 8분 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>5 x g 에서 1 분 동안 원심 분리합니다 (심방 세포 만, 심실 세포에는 침전으로 충분합니다).</li>
	<li>상층액을 버리고 400μM 칼슘 농도의 티로드 용액 10mL에 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.</li>
	<li>침전을 위해 세포를 8분 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>5 x g 에서 1 분 동안 원심 분리합니다 (심방 세포 만, 심실 세포에는 침전으로 충분합니다).</li>
	<li>상층액을 버리고 펠릿을 1mM 칼슘 농도의 티로드 용액 5mL(심방)/1mL(심실)에 조심스럽게 재현탁합니다.</li>
</ol>5. 형광 칼슘 지표 Fluo-3 AM으로 근세포 로딩
알림: 형광 칼슘 표시기의 감광성으로 인해 다음 단계는 빛으로부터 보호되어야 합니다(예: 튜브를 알루미늄 호일로 덮음).
<ol><li>무수 DMSO에 20% 플루로닉 F-127 44μL를 50μg의 Fluo-3AM에 첨가하여 Fluo-3 AM 원액을 준비합니다(빛으로부터 보호되는 -20°C에서 보관 가능).</li>
	<li>10 μL의 Fluo-3 AM 원액을 1 mL의 세포 현탁액에 첨가하고 빛으로부터 보호되는 실온에서 10 분 동안 배양합니다.</li>
	<li>5 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 상청액을 버리고 펠릿을 적절한 양의 목욕 용액에 재현탁하여 좋은 작업 농도(세포 밀도에 따라 1-5mL의 목욕 용액)를 얻습니다.</li>
	<li>실험을 시작하기 전에 에스테르 제거를 위해 30분 동안 그대로 두십시오.</li>
</ol>6. 앞서 설명한 바와 같이 동시 패치 클램프 및 epifluorescent Ca2+-과도 측정16
알림: 패치 clamp 측정은 이 기사의 주제가 아니며 관심 있는 독자는 이 방법 17,18,19,20,21,22에 대한 자세한 설명을 제공하는 주요 간행물을 참조할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 더 나은 전반적인 이해를 위해, 현재 유도된 칼슘 과도 현상과 함께 L형 칼슘 전류를 측정하기 위한 프로토콜에 대한 요약이 제공된다.
<ol><li>근세포를 세포 챔버로 옮기고 37°C에서 수조 용액으로 슈퍼퓨즈합니다.</li>
	<li>표 5에 표시된 대로 4-아미노피리딘과 염화바륨을 수조 용액에 첨가하여 칼륨 전류를 차단합니다.</li>
	<li>붕규산 미세 전극의 팁 저항이 피펫 용액으로 채워진 2-5MΩ인지 확인합니다(표 6).</li>
	<li>전기 신호와 에피형광을 동시에 기록할 수 있도록 측정을 설정합니다. 전압 클램프 모드는 전지를 -80mV로 유지하고 600ms의 램프 펄스를 -40mV로 유지하여 빠른 Na+ 전류를 비활성화한 다음 0.5Hz에서 +10mV까지 100ms 테스트 펄스를 유지하는 프로토콜로 L형 Ca2+ 전류를 측정하는 데 사용됩니다(그림 2).</li>
	<li>488 nm에서 여기, <520 nm에서 방출된 빛을 사용하여 검출하고 [Ca2+]I 로 변환한다고 가정합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61964/61964equ01.jpg"> 여기서 kd = Fluo-3 (864 nM)의 해리 상수, F = Fluo-3 형광; Fmax =Ca2+-포화 형광은 각 실험종료 시 얻어진다 19.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Camm, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation:+the+Task+force+for+the+management+of+atrial+fibrillation+of+the+European+Society+of+Cardiology+(ESC).">Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).</li><li>Chugh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+epidemiology+of+atrial+fibrillation:+a+global+burden+of+disease+2010+study.">Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study.</a> Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).</li><li>Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+whom+the+bell+tolls+:+Refining+risk+assessment+for+sudden+cardiac+death.">For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death.</a> Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).</li><li>Kirchhof, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2016+ESC+Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation+developed+in+collaboration+with+EACTS.">2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS.</a> European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).</li><li>Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiarrhythmic+drugs+for+treatment+of+atrial+fibrillation.">New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation.</a> Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).</li><li>Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+isolation+and+culture+of+atrial+myocytes,+ventricular+myocytes,+and+non-myocytes+from+an+adult+mouse+heart.">Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>K&#246;hncke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Kv+channel+recordings+in+murine+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+inflammatory+and+fibrogenic+pathways+in+heart+failure+associated+with+aging.">The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging.</a> Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).</li><li>Pla&#269;ki&#263;, J., Kocksk&#228;mper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes+for+in+vitro+studies.">Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).</li><li>D&#237;az, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes.">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).</li><li>Zimmerman, A. N., H&#252;lsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart.">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).</li><li>Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=With+or+without+Langendorff:+A+new+method+for+adult+myocyte+isolation+to+be+tested+with+time.">With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time.</a> Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).</li><li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution,+contraction,+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts.">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).</li><li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart.">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li><li>Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+optical+action+potential+measurement+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).</li></ol>

이 기사는 동시 칼슘 과도 기록과 함께 패치 클램프 연구를 위해 동일한 마우스에서 고품질 심방 및 심실 근세포를 얻을 수 있는 쉽고 기능적인 방법을 제공합니다. 얻어진 데이터의 품질은 세포 분리의 품질에 크게 의존한다. 상기 언급한 바와 같이, 쥐 심근세포를 단리하는 많은 방법들이 이전에 기술되었다 9,10,11,12....

심장 부정맥은 흔하며 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치기 때문에 현재 주요 의료 문제 중 하나입니다. 부정맥은 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있으며1,2 대부분의 심장 돌연사3의 근본 원인이다. 최신 치료 옵션은 환자 생존율을 향상시켰지만 여전히 기본 메커니즘을 표적으로 삼기보다는 주로 대증 치료입니다. 따라서, 이러한 치료법은 효능이 제한적이며 종종 심각한 부작용을 일으킬 수 있다 4,5,6. 현재 치료 옵션을 개선하려면 근본적인 병태생리학에 대한 통찰력이 필요하므로 연구에 적합한 모델이 필요합니다. 작은 동물 모델, 특히 마우스 모델은 부정맥 생성의 주요 메커니즘, 예를 들어 세포 전기 생리학, 이온 채널 기능 또는 칼슘 처리에 대한 유전 적 영향을 연구 할 수 있기 때문에 부정맥 연구에서 중요한 역할을합니다 7,8.
이를 위해서는 충분한 양과 생존력을 가진 고립 된 심방 및 심실 심근 세포가 필요합니다. 심방 및 심실 근세포를 얻기 위한 다양한 분리 접근법의 광범위한 스펙트럼이 이전에 설명되었으며9,10,11,12,13 일부 그룹은 심방 14 또는 심실 15에서 L형 전류 및 칼슘 전류 유도 칼슘 과도 현상의 동시 측정 데이터를 제시했습니다 쥐 심근 세포. 그러나 우리가 아는 한 동물의 심방 및 심실 측정에 대한 데이터는 없습니다. 연구자들은 전기생리학에서 단백질체학, 세포 수축성 또는 단백질 상호 작용과 같은 기능 연구, 미토콘드리아 기능 또는 유전학에 이르기까지 다양한 주제에 중점을 두고 있으며, 이 모든 것은 분리된 심근 세포를 필요로 합니다. 따라서 발표된 프로토콜 중 다수는 패치 클램프 연구를 위해 특별히 개발되지 않았기 때문에 패치 클램프 연구를 위한 수율이 제한되고 세포 품질이 불충분했습니다. 따라서 한 동물에서 분리된 심방 및 심실 세포의 동시 패치 클램프 및 칼슘 과도 측정은 확립된 프로토콜로 수행할 수 없습니다.
패치 클램프 실험을 위한 쥐, 특히 심방 근세포의 분리는 여전히 어려운 과제입니다. 이 기사는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 간단하고 빠른 방법을 제공하며, 이를 통해 한 동물에서 순 막 전류와 전류 유도 칼슘 과도 현상을 동시에 측정할 수 있습니다. 이 기사는 야생형 마우스와 유전적 돌연변이를 가진 마우스에서 파생된 심방 및 심실 근세포의 분리를 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 수컷과 암컷 마우스 모두에 사용할 수 있습니다. 아래에 기술된 근세포 분리, 이미지 및 대표적인 결과는 6개월(± 1)개월의 야생형 C57Bl/6 마우스에서 얻었습니다. 그럼에도 불구하고, 이 프로토콜은 상이한 유전자형을 갖는 2개월에서 24개월에 이르는 다양한 연령의 마우스에 성공적으로 사용되었다. 그림 1 은 효소 관류 중 캐뉼러화된 심장의 분리 설정 및 확대 사진을 보여줍니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G cannula</td>
			<td>Servoprax</td>
			<td>L10220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A78403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic cannula</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130163-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt surgical forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650915-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12133C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating heated water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>ME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS994177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disscetion scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS600124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-aspartat K+-salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F3715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate tris salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating coil</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>25.000 IE/5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>induction chamber</td>
			<td>CWE incorporated</td>
			<td>13-40020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jacketed heart chamber</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049360250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl x 6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh (200 &#181;m)</td>
			<td>VWR-Germany</td>
			<td>510-9527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pasteur pipette</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z331759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri-dishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic Acid F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM597D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650908-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS700540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suturing silk</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NC9416241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z683531-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>86330</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of high quality murine atrial and ventricular myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and l-type calcium current

마우스 모델은 부정맥 연구에서 중요한 역할을 하며 변경된 이온 채널 기능 및 칼슘 처리를 포함한 부정맥 생성의 주요 메커니즘을 연구할 수 있습니다. 이를 위해 고품질의 심방 또는 심실 심근 세포는 패치 클램프 측정을 수행하거나 칼슘 취급 이상을 탐색하는 데 필요합니다. 그러나 현재 격리 프로토콜에 의해 얻어진 고품질 심근 세포의 제한된 수율은 동일한 마우스에서 두 측정을 모두 허용하지 않습니다. 이 기사에서는 역행성 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하여 한 동물에서 칼슘 과도 현상 및 L형 칼슘 전류를 동시에 측정하는 방법을 설명합니다. 마우스 심장을 채취하고, 대동맥을 빠르게 캐뉼라 화하여 혈액을 제거합니다. 그런 다음 심장은 처음에 칼슘이 없는 용액(37°C)으로 관류되어 삽입된 디스크 수준에서 조직을 해리한 다음 세포외 기질(37°C)을 파괴하기 위해 칼슘이 거의 포함되지 않은 효소 용액으로 관류합니다. 소화 된 심장은 이후 심방과 심실로 해부됩니다. 조직 샘플을 작은 조각으로 잘게 썰고 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 용해시킵니다. 효소 소화가 중단되고 세포가 생리적 칼슘 농도로 단계적으로 재도입됩니다. 형광 Ca2+ 지시약으로 로딩 한 후, 칼슘 전류와 과도 현상을 동시에 측정하기 위해 분리 된 심근 세포를 준비합니다. 또한, 분리 함정이 논의되고, 위에서 설명한 바와 같이 분리된 심방 및 심실 쥐 근세포에서 동시 칼슘 과도 측정과 함께 L형 칼슘 전류의 패치 클램프 프로토콜 및 대표적인 흔적이 제공됩니다.

분리 수율은 칼슘 재도입 후 10 μL의 세포 현탁액을 현미경 슬라이드에 피펫팅하여 측정합니다. 심방 세포 분리를 위한 100개 이상의 생존 가능한 막대 모양의 비수축 세포/10μL 및 심실 세포 분리를 위한 1,000개 이상의 생존 가능한 막대 모양의 비수축 세포/10μL가 충분한 수율로 간주되며 일반적으로 이 프로토콜을 사용하여 얻습니다. 이 프로토콜로 얻은 심방 세포는 심장 전도 시스템의 세포, 특?...

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Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

isolation-high-quality-murine-atrial-ventricular-myocytes-for

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

2.9K 조회수.  Ludwig-Maximilians University Munich (LMU). 마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.

비디오: Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

공촛점 이미징에 대한 분리 및 성인 심장 Myocytes의 유전자 조작

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

연구

생물학

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

손쥐 심방과 심실 Cardiomyocytes의 절연 및 KV 채널 레코딩

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup&gt; 2 +</sup&gt; 과도하고 막 전류

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

표적화 된 Ca를 이용한 ER / SR 칼슘 방출 모니터링<sup&gt; 2+</sup&gt; 센서 캐쳐<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...