Diese Arbeit wurde gefördert von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG; Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 an P. Tomsits und D. Schüttler; VO1568/3-1, IGK 1816 und SFB1002 Projekt A13 bis N. Voigt), Deutsche Forschungsgemeinschaft im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder (EXC 2067/1- 390729940 an N. Voigt), Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK; 81X2600255 an S. Clauss und N. Voigt; 81Z0600206 an S. Kääb), die Corona-Stiftung (S199/10079/2019 an S. Clauss), das ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 an S. Clauss), die Heinrich-und-Lotte-Mühlfenzl-Stiftung (an S. Clauss) und die Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (EKFS 2016_A20 an N. Voigt). Die Geldgeber spielten bei der Vorbereitung des Manuskripts keine Rolle.

Alle Tierverfahren wurden vom Niedersächsischen Tierprüfungsamt (LAVES, AZ-18/2900) genehmigt und in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für den Tierschutz durchgeführt.
1. Vorbereitungen
<ol><li>Bereiten Sie 1 l 10x Perfusionspuffer (Tabelle 1), 500 ml 1x Perfusionspuffer (Tabelle 2), 50 ml Aufschlusspuffer (Tabelle 3), 10 ml Stopppuffer (Tabelle 4), 1 l Tyrode-Lösung (Tabelle 5), 10 ml jeder Calcium-Stufenlösung (Tyrode-Lösung mit Glukose und entsprechender Menge an Calcium wie angegeben) vor. 1 l 4-AP-Lösung (Tabelle 5), 100 ml Pipettenlösung (Tabelle 6) und 5 ml Pluronsäure gemäß den bereitgestellten Rezepturen. HINWEIS: Badlösungen (Tyrode und 4-AP-Lösung) können (ohne Glukose) im Voraus zubereitet und bei +4 °C gelagert werden, Glukose wird am Versuchstag hinzugefügt. Die Pipettenlösung kann bei -20 °C gelagert werden, der Calciumindikator wird am Versuchstag zugegeben und die Lösung dann bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelagert. 10x Perfusionspuffer kann bei Raumtemperatur gelagert werden, 1x Perfusionspuffer, Verdauungspuffer und Stopppuffer sollten am Versuchstag frisch zubereitet werden.</li>
	<li>Schalten Sie das Wasserbad und die Rollenpumpe ein.</li>
	<li>Langendorff-Apparatur mit Perfusionspuffer vorfüllen; Stellen Sie sicher, dass es luftfrei ist.</li>
	<li>Bereiten Sie die Aortenkanüle vor, indem Sie sie unter dem Präpariermikroskop fixieren, mit einer 1-ml-Spritze verbinden, die mit Perfusionspuffer gefüllt ist, und reinigen Sie die Kanüle, indem Sie die Kanüle ausspülen. HINWEIS: Es ist wichtig, jegliche Luft im Perfusionssystem zu vermeiden, da dies die koronare Perfusion und damit die Verdauungseffektivität direkt beeinflusst. Bei Bedarf kann dem Setup eine Blasenfalle hinzugefügt werden, um Lufteinschlüsse sicher zu vermeiden.</li>
	<li>Bereiten Sie Petrischalen mit ausreichend Perfusionspuffer für die Organentnahme und die Mikroskopie vor (Puffer sollte das gesamte Organ sicher bedecken, einige Milliliter – je nach verwendeter Petrischalegröße – sollten ausreichen).</li>
	<li>Bereiten Sie 3 Petrischalen mit Verdauungspuffer für die Gewebedissoziation und Mikroskopie vor, der Puffer sollte das Organ für die Präparation unter dem Mikroskop in der jeweiligen Petrischale bedecken, die Menge hängt von der verwendeten Petrischalegröße ab. Für die Dissoziation verwenden Sie 3 ml für ventrikuläres Gewebe und 1,5 ml für Vorhofgewebe.</li>
</ol>2. Organentnahme
<ol><li>Injizieren Sie der Maus 0,1 ml Heparin (1.000 U/ml) i.p. mit einer 1-ml-Spritze mit einer 27-g-Kanüle und warten Sie 5-10 Minuten.</li>
	<li>Legen Sie die Maus zusammen mit einem kleinen Gewebe, das mit ca. 500 μl Isofluran getränkt ist, in eine Induktionskammer. Das Tier sollte nicht mit dem Gewebe in Berührung kommen. Um dies zu vermeiden, kann man eine Biopsie-Einbettungskassette aus Kunststoff verwenden, um das Gewebe abzudecken. Sobald das Tier vollständig betäubt ist, überprüfen Sie den Zehenquetschreflex und sobald er nicht mehr vorhanden ist, schläfern Sie die Maus schnell durch Zervixluxation ein.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf eine Plattform auf dem Rücken (z. B. auf Styropor, das mit einem Papiertuch bedeckt ist) und fixieren Sie die Pfoten mit Kanülen, um sie an Ort und Stelle zu halten.</li>
	<li>Entfernen Sie das Fell und die Haut, die die Brust und einen Teil des Bauches bedecken, mit einem deutlichen Schnitt vom Jugulum in Richtung Symphyse und öffnen Sie den Bauch direkt unter dem Xipoid, ohne eine Organstruktur mit einer Schere zu verletzen. Heben Sie das Brustbein mit einer chirurgischen Zange an und schneiden Sie das Zwerchfell mit einer Schere entlang der Rippenkante durch, schneiden Sie dann die Rippen in der medialen Achsellinie ab und entfernen Sie den Brustkorb, um das Herz freizulegen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Herzbeutel vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette und entfernen Sie das Herz schnell, indem Sie es mit einer stumpfen Pinzette von unten anheben und die großen Gefäße mit einem einzigen Schnitt mit einer Schere durchtrennen.</li>
	<li>Geben Sie das Herz in einen Perfusionspuffer bei Raumtemperatur und kanülieren Sie die Aorta mit einer stumpfen Endnadel so schnell wie möglich unter dem Mikroskop. Anmerkungen: Entfernen Sie jegliches Lungengewebe und Fettgewebe, das mit dem Organ verbunden ist, ohne zu viel Zeit damit zu verlieren. Achten Sie bei der Kanülierung darauf, dass das Ende der Nadel nicht durch die Aortenklappe ragt, da dies die Ergebnisse beeinträchtigt, da Puffer nicht in die Koronararterien gelangen.</li>
	<li>Binden Sie das Herz mit einem Stück Nahtseide fest an die Nadel und trennen Sie es von der Spritze. HINWEIS: Der gesamte Vorgang von der Gewinnung des Herzens (dem Moment, in dem die großen Gefäße durchtrennt werden) bis zum Nähen der Aorta an die Nadel sollte so wenig Zeit wie möglich in Anspruch nehmen. Es wird empfohlen, von der Entfernung des Herzens bis zum Beginn der Perfusion nicht länger als 90-180 s zu dauern.</li>
</ol>3. Enzymatische Verdauung
<ol><li>Nach der Aortenkanülierung wird das kanülierte Herz sofort an den Langendorff-Apparat angeschlossen, um das Eindringen von Luft in das System zu vermeiden. Anmerkungen: Es kann hilfreich sein, einen hängenden Tropfen Perfusionspuffer an der Unterseite der Langendorff-Apparatur sowie einen Tropfen Perfusionspuffer auf der Oberseite der Nadel zu haben, um zu verhindern, dass Luft in das System eindringt.</li>
	<li>Perfundieren Sie das Herz 1 min lang mit Perfusionspuffer bei einer Temperatur von exakt 37 °C und einer Perfusionsrate von exakt 4 mL/min. HINWEIS: Um eine Temperatur von 37 °C an der Spitze der Perfusionsnadel zu erreichen, muss die Wasserbadtemperatur leicht über ca. 40 °C eingestellt werden. Dies sollte regelmäßig durch Messung der Temperatur an der Perfusionsspitze überprüft werden.</li>
	<li>Perfusion auf Aufschlusspuffer umschalten und für exakt 9 min bei einer Temperatur von exakt 37 °C und einer Perfusionsrate von exakt 4 mL/min perfundieren.</li>
	<li>Übertragen Sie das verdaute Herz in eine Petrischale mit genügend Verdauungspuffer, um es vollständig bedeckt zu halten. Anschließend werden die Vorhöfe und Herzkammern unter dem Mikroskop sorgfältig präpariert.</li>
	<li>Übertragen Sie die Vorhöfe in eine Petrischale mit 1,5 ml Verdauungspuffer und die Ventrikel in eine andere Petrischale mit 3 ml Verdauungspuffer.</li>
	<li>Vorhofdissektion<ol><li>Ziehen Sie die Vorhöfe vorsichtig, aber ohne Zeitverlust mit einer stumpfen Pinzette in winzige Stücke auseinander.</li>
		<li>Lösen Sie das Gewebe auf, indem Sie mit einer 1.000-μl-Pipettenspitze, die zuvor geschnitten wurde, um die Spitzenöffnung zu erweitern, vorsichtig auf und ab pipettieren.</li>
		<li>Übertragen Sie die Lösung in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie eine entsprechende Menge Stopppuffer (1,5 ml) hinzu, indem Sie vorsichtig an der Seite des Röhrchens nach unten pipettieren, um die Reaktion zu beenden.</li>
		<li>Führen Sie alle 3 ml Zell-/Gewebelösungen vorsichtig durch ein 200 μm Nylonnetz, um verbleibende größere Gewebestücke zu entfernen, die nicht vollständig verdaut wurden. HINWEIS: Eine erfolgreiche Verdauung hinterlässt fast keine festen Brocken.</li>
	</ol></li>
	<li>Ventrikuläre Dissektion<ol><li>Hacken Sie das Ventrikelgewebe schnell mit einer Sezierschere in winzige Stücke und pipettieren Sie es auf und ab, um es aufzulösen. Verwenden Sie eine weitere 1.000-μl-Pipettenspitze zum Auf- und Abpipettieren, sie kann gekürzt werden, um die Öffnung zu erweitern.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zell-/Gewebelösung in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie eine entsprechende Menge Stopppuffer (3 ml) hinzu, indem Sie vorsichtig an der Seite des Röhrchens nach unten pipettieren, um die Reaktion zu beenden.</li>
		<li>Führen Sie alle 6 ml Zell-/Gewebelösung vorsichtig durch ein 200 μm Nylonnetz, um größere Gewebestücke zu entfernen, die noch nicht vollständig verdaut sind. HINWEIS: Eine erfolgreiche Verdauung hinterlässt fast keine festen Brocken.</li>
	</ol></li>
	<li>Lassen Sie beide Röhrchen (Vorhof- und Ventrikelzellsuspension) 6 Minuten lang bei Raumtemperatur auf der Bank, damit sie sich absetzen können.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie beide 15-ml-Röhrchen bei 5 x g für 2 min.</li>
</ol>4. Wiedereinführung von Kalzium
HINWEIS: Die folgenden Schritte sind sowohl für Vorhof- als auch für Ventrikelzellen identisch (sofern nicht anders angegeben) und werden bei Raumtemperatur durchgeführt.
<ol><li>Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 10 ml kalziumfreier Tyrode-Lösung.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen 8 Minuten zur Sedimentation stehen.</li>
	<li>Bei 5 x g für 1 min zentrifugieren (nur Vorhofzellen, Sedimentation reicht für Ventrikelzellen).</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 10 ml Tyrode-Lösung mit einer Calciumkonzentration von 100 μM.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen 8 Minuten zur Sedimentation stehen.</li>
	<li>Bei 5 x g für 1 min zentrifugieren (nur Vorhofzellen, Sedimentation reicht für Ventrikelzellen).</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 10 ml Tyrode-Lösung mit einer Calciumkonzentration von 400 μM.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen 8 Minuten zur Sedimentation stehen.</li>
	<li>Bei 5 x g für 1 min zentrifugieren (nur Vorhofzellen, Sedimentation reicht für Ventrikelzellen).</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 1 ml (atrial)/5 ml (ventrikulär) Tyrode-Lösung mit einer Calciumkonzentration von 1 mM.</li>
</ol>5. Beladung von Myozyten mit fluoreszierendem Calcium-Indikator Fluo-3 AM
HINWEIS: Aufgrund der Lichtempfindlichkeit des fluoreszierenden Calciumindikators sollten die folgenden Schritte lichtgeschützt durchgeführt werden (z.B. durch Abdecken der Röhrchen mit Aluminiumfolie).
<ol><li>Bereiten Sie die Fluo-3 AM-Stammlösung vor, indem Sie 44 μl 20 % pluronisches F-127 in wasserfreiem DMSO zu 50 μg Fluo-3AM hinzufügen (kann bei -20 °C lichtgeschützt gelagert werden).</li>
	<li>10 μl Fluo-3 AM-Stammlösung zu 1 ml Zellsuspension geben und 10 min bei lichtgeschützter Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Bei 5 x g 1 min zentrifugieren.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff und resuspendieren Sie das Pellet in einer angemessenen Menge Badlösung, um eine gute Arbeitskonzentration zu erzielen (1-5 ml Badlösung, je nach Zelldichte).</li>
	<li>30 Minuten zur Entesterung einwirken lassen, bevor Sie mit den Experimenten beginnen.</li>
</ol>6. Simultane Patch-Clamp- und epifluoreszierendeCa2+-Transientenmessungen wie zuvor beschrieben16
HINWEIS: Patch-Clamp-Messungen sind nicht das Thema dieses Artikels, der interessierte Leser kann auf wichtige Publikationen verwiesen werden, die diese Methode ausführlich beschreiben 17,18,19,20,21,22. Nichtsdestotrotz wird zum besseren Gesamtverständnis eine Zusammenfassung eines Protokolls zur Messung von L-Typ-Kalziumströmen zusammen mit strominduzierten Kalziumtransienten bereitgestellt.
<ol><li>Die Myozyten werden in eine Zellkammer überführt und mit einer Badelösung bei 37 °C überflossen.</li>
	<li>Blockieren Sie Kaliumströme, indem Sie der Badelösung 4-Aminopyridin und Bariumchlorid hinzufügen, wie in Tabelle 5 angegeben.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass Borosilikat-Mikroelektroden einen Spitzenwiderstand von 2-5 MΩ aufweisen, die mit Pipettenlösung gefüllt sind (Tabelle 6).</li>
	<li>Setup-Messungen, um die gleichzeitige Aufzeichnung von elektrischen Signalen und Epifluoreszenz zu ermöglichen. Der Voltage-Clamp-Modus wird verwendet, um den L-Typ Ca2+-Strom mit einem Protokoll zu messen, das die Zelle bei -80 mV hält, und einem 600 ms Rampenimpuls auf -40 mV, um den schnellen Na+-Strom zu inaktivieren, gefolgt von einem 100 ms Testimpuls auf +10 mV bei 0,5 Hz (Abbildung 2).</li>
	<li>Verwenden Sie Anregung bei 488 nm, emittiertes Licht bei <520 nm, um es zu detektieren und in [Ca2+]I umzuwandeln, unter der Annahme, dass <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61964/61964equ01.jpg"> Dabei ist kd = Dissoziationskonstante von Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3-Fluoreszenz; Fmax = Ca2+-gesättigte Fluoreszenz, die am Ende jedes Experiments19 erhalten wurde.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Camm, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation:+the+Task+force+for+the+management+of+atrial+fibrillation+of+the+European+Society+of+Cardiology+(ESC).">Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).</li><li>Chugh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+epidemiology+of+atrial+fibrillation:+a+global+burden+of+disease+2010+study.">Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study.</a> Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).</li><li>Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+whom+the+bell+tolls+:+Refining+risk+assessment+for+sudden+cardiac+death.">For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death.</a> Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).</li><li>Kirchhof, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2016+ESC+Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation+developed+in+collaboration+with+EACTS.">2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS.</a> European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).</li><li>Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiarrhythmic+drugs+for+treatment+of+atrial+fibrillation.">New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation.</a> Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).</li><li>Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+safety+assays.">Cardiac safety assays.</a> Current opinion in pharmacology. 15, 16-21 (2014).</li><li>Sch&#252;ttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atrial+fibrillation.">Animal models of atrial fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolating+atrial+cells+from+large+mammals+and+humans.">Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).</li><li>Jansen, H. J., Rose, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+atrial+myocytes+from+adult+mice.">Isolation of atrial myocytes from adult mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).</li><li>Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+isolation+and+culture+of+atrial+myocytes,+ventricular+myocytes,+and+non-myocytes+from+an+adult+mouse+heart.">Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61224 (2020).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Report. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>K&#246;hncke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Kv+channel+recordings+in+murine+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).</li><li>Brandenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axial+tubule+junctions+activate+atrial+Ca(2+)+release+across+species.">Axial tubule junctions activate atrial Ca(2+) release across species.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1227 (2018).</li><li>Hofhuis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin+links+excitation-contraction+coupling+to+structure+and+maintenance+of+the+cardiac+transverse-axial+tubule+system.">Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system.</a> Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).</li><li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2++transients+and+membrane+currents.">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).</li><li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+I(K,ACh)+channels+in+the+diseased+heart.">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart.</a> Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).</li><li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart.">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).</li><li>Trafford, A. W., D&#237;az, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca+content+in+cardiac+ventricular+myocytes.">A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 437 (3), 501-503 (1999).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++leak+and+increased+Na+-Ca2++exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).</li><li>Fakuade, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+atrial+cytosolic+calcium+handling+contributes+to+the+development+of+postoperative+atrial+fibrillation.">Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. , (2020).</li><li>Chen, W., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+inflammatory+and+fibrogenic+pathways+in+heart+failure+associated+with+aging.">The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging.</a> Heart Failure Reviews. 15 (5), 415-422 (2010).</li><li>Pla&#269;ki&#263;, J., Kocksk&#228;mper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes+for+in+vitro+studies.">Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).</li><li>D&#237;az, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes.">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).</li><li>Zimmerman, A. N., H&#252;lsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart.">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).</li><li>Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=With+or+without+Langendorff:+A+new+method+for+adult+myocyte+isolation+to+be+tested+with+time.">With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time.</a> Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).</li><li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution,+contraction,+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts.">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).</li><li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart.">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li><li>Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+optical+action+potential+measurement+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).</li></ol>

Dieser Artikel bietet eine einfache und funktionelle Möglichkeit, qualitativ hochwertige atriale und ventrikuläre Myozyten von derselben Maus für Patch-Clamp-Studien mit gleichzeitigen transienten Kalziumableitungen zu erhalten. Die Qualität der gewonnenen Daten hängt stark von der Qualität der Zellisolierung ab. Wie oben erwähnt, wurden bereits viele Verfahren zur Isolierung von murinen Kardiomyozyten beschrieben 9,10,11,12.</...

Herzrhythmusstörungen sind weit verbreitet und eine der größten Herausforderungen im Gesundheitswesen, da sie Millionen von Menschen weltweit betreffen. Herzrhythmusstörungen sind mit einer hohen Morbidität und Mortalität assoziiert 1,2 und stellen die zugrunde liegende Ursache für die Mehrzahl der plötzlichen Herztodedar 3. Heutige Behandlungsoptionen haben das Überleben der Patienten verbessert, sind aber immer noch hauptsächlich symptomatische Behandlungen, anstatt auf die zugrunde liegenden Mechanismen abzuzielen. Daher sind diese Behandlungen nur begrenzt wirksam und können häufig schwere Nebenwirkungen verursachen 4,5,6. Eine Verbesserung der derzeitigen Behandlungsmöglichkeiten erfordert Einblicke in die zugrunde liegende Pathophysiologie, was die Notwendigkeit geeigneter Modelle für die Untersuchung schafft. Kleintiermodelle - und insbesondere Mausmodelle - spielen eine entscheidende Rolle in der Arrhythmieforschung, da sie es ermöglichen, Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese zu untersuchen, z. B. den genetischen Einfluss auf die zelluläre Elektrophysiologie, die Funktion der Ionenkanäle oder den Umgang mit Kalzium 7,8.
Zu diesem Zweck werden isolierte atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten in ausreichender Menge und Viabilität benötigt. Ein breites Spektrum unterschiedlicher Isolationsansätze zur Gewinnung von atrialen und ventrikulären Myozyten wurde bereits beschrieben 9,10,11,12,13, und einige Gruppen haben Daten aus gleichzeitigen Messungen von L-Typ-Strom und Kalziumstrom-induzierten Kalziumtransienten entweder aus dem Vorhof 14 oder dem Ventrikel 15 vorgelegt Kardiomyozyten der Maus. Unseres Wissens nach liegen jedoch keine Daten zu Vorhof- und Ventrikelmessungen eines Tieres vor. Die Forscher konzentrieren sich auf eine breite Palette von Themen, die von Elektrophysiologie über Proteomik, funktionelle Studien wie Zellkontraktilität oder Proteininteraktionen, mitochondriale Funktion bis hin zur Genetik reichen – alle benötigen isolierte Kardiomyozyten. Viele der veröffentlichten Protokolle wurden daher nicht speziell für Patch-Clamp-Studien entwickelt, was zu begrenzten Ausbeuten und unzureichender Zellqualität für Patch-Clamp-Studien führt. Daher können simultane Patch-Clamp- und Calcium-Transientenmessungen von Vorhof- und Ventrikelzellen, die aus einem Tier isoliert wurden, mit etablierten Protokollen nicht durchgeführt werden.
Die Isolierung von murinen – insbesondere atrialen – Myozyten für Patch-Clamp-Experimente ist nach wie vor eine Herausforderung. Dieser Artikel stellt eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung hochwertiger muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion vor, die anschließend die gleichzeitige Messung von Nettomembranstrom und strominduzierten Kalziumtransienten von einem Tier ermöglicht. In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Isolierung von atrialen und ventrikulären Myozyten aus Wildtyp-Mäusen und Mäusen mit genetischen Mutationen ausgearbeitet. Dieses Protokoll kann sowohl für männliche als auch für weibliche Mäuse verwendet werden. Die Myozytenisolierung, die Bilder und die repräsentativen Ergebnisse, die unten beschrieben werden, wurden von Wildtyp-C57Bl/6-Mäusen im Alter von 6 (± 1) Monaten erhalten. Nichtsdestotrotz wurde dieses Protokoll erfolgreich bei Mäusen im Alter von 2 bis 24 Monaten mit unterschiedlichen Genotypen eingesetzt. Abbildung 1 zeigt den Isolationsaufbau und eine Nahaufnahme eines kanülierten Herzens während der Enzymperfusion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G cannula</td>
			<td>Servoprax</td>
			<td>L10220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A78403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic cannula</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130163-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt surgical forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650915-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12133C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating heated water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>ME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS994177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disscetion scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS600124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-aspartat K+-salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F3715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate tris salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating coil</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>25.000 IE/5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>induction chamber</td>
			<td>CWE incorporated</td>
			<td>13-40020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jacketed heart chamber</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049360250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl x 6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh (200 &#181;m)</td>
			<td>VWR-Germany</td>
			<td>510-9527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pasteur pipette</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z331759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri-dishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic Acid F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM597D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650908-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS700540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suturing silk</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NC9416241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z683531-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>86330</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of high quality murine atrial and ventricular myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and l-type calcium current

Mausmodelle spielen eine entscheidende Rolle in der Arrhythmieforschung und ermöglichen die Untersuchung von Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese, einschließlich der veränderten Ionenkanalfunktion und des Kalziumhandlings. Zu diesem Zweck sind atriale oder ventrikuläre Kardiomyozyten von hoher Qualität notwendig, um Patch-Clamp-Messungen durchzuführen oder Calcium-Handling-Anomalien zu untersuchen. Die begrenzte Ausbeute an qualitativ hochwertigen Kardiomyozyten, die mit den derzeitigen Isolationsprotokollen gewonnen wird, erlaubt jedoch nicht beide Messungen in derselben Maus. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Isolierung hochwertiger muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion für die anschließende simultane Messung von Calciumtransienten und L-Typ-Calciumstrom von einem Tier. Mäuseherzen werden gewonnen, und die Aorta wird schnell kanüliert, um Blut zu entfernen. Die Herzen werden dann zunächst mit einer kalziumfreien Lösung (37 °C) perfundiert, um das Gewebe auf der Ebene der interkalierten Bandscheiben zu dissoziieren, und anschließend mit einer Enzymlösung, die wenig Kalzium enthält, um die extrazelluläre Matrix (37 °C) zu stören. Das verdaute Herz wird anschließend in Vorhöfe und Ventrikel zerlegt. Gewebeproben werden in kleine Stücke zerkleinert und durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren aufgelöst. Die enzymatische Verdauung wird gestoppt und die Zellen werden schrittweise wieder in physiologische Kalziumkonzentrationen gebracht. Nach Beladung mit einem fluoreszierenden Ca2+-Indikator werden isolierte Kardiomyozyten für die simultane Messung von Calciumströmen und -transienten präpariert. Darüber hinaus werden Isolationsfallstricke diskutiert und Patch-Clamp-Protokolle und repräsentative Spuren von L-Typ-Calciumströmen mit simultanen Calciumtransientenmessungen in atrialen und ventrikulären murinen Myozyten, die wie oben beschrieben isoliert wurden, bereitgestellt.

Die Isolationsausbeute wird nach der Wiedereinführung von Calcium bestimmt, indem 10 μl Zellsuspension auf einen Objektträger pipettiert werden. Mehr als 100 lebensfähige, stäbchenförmige, nicht kontrahierende Zellen/10 μl für die Isolierung von Vorhofzellen und mehr als 1.000 lebensfähige, stäbchenförmige, nicht kontrahierende Zellen/10 μl für die Isolierung ventrikulärer Zellen gelten als ausreichende Ausbeute und werden üblicherweise mit diesem Protokoll gewonnen. Vorhofzellen, die mit diesem Protokoll ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current at JoVE.com

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mausmodelle ermöglichen es, Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese zu untersuchen. Zu diesem Zweck sind qualitativ hochwertige Kardiomyozyten notwendig, um Patch-Clamp-Messungen durchzuführen. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Isolierung muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion beschrieben, die simultane Messungen von Calcium-Transienten und L-Typ-Calciumstrom ermöglicht.

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

isolation-high-quality-murine-atrial-ventricular-myocytes-for

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

2.9K Aufrufe.  Ludwig-Maximilians University Munich (LMU). Mausmodelle ermöglichen es, Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese zu untersuchen. Zu diesem Zweck sind qualitativ hochwertige Kardiomyozyten notwendig, um Patch-Clamp-Messungen durchzuführen. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Isolierung muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion beschrieben, die simultane Messungen von Calcium-Transienten und L-Typ-Calciumstrom ermöglicht.

Serie: Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Forschung

Biologie

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolierung und Kv Kanal Recordings in Murine atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

Isolierung humaner Vorhofmyozyten für gleichzeitige Messungen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transienten und Membrane Currents

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Spannung und Calcium Dual Channel Optical Mapping von Cultured HL-1 Vorhofmuskelzellen Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

Gleichzeitige Isolierung von hochwertigen Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten aus einem erwachsenen Rattenherz

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

Monitoring ER / SR Calcium Release mit dem gezielten Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor Catcher<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...