Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG; Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 à P. Tomsits et D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 et SFB1002 projet A13 à N. Voigt), Fondation allemande pour la recherche dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne (EXC 2067/1- 390729940 à N. Voigt), Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK; 81X2600255 à S. Clauss et N. Voigt; 81Z0600206 à S. Kääb), la Fondation Corona (S199/10079/2019 à S. Clauss), l’ERA-NET sur les maladies cardiovasculaires (ERA-CVD; 01KL1910 à S. Clauss), la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (à S. Clauss) et la Fondation Else-Kröner-Fresenius (EKFS 2016_A20 à N. Voigt). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la préparation des manuscrits.

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Conseil d’examen des animaux de Basse-Saxe (LAVES, AZ-18/2900) et ont été menées conformément à toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être animal.
1. Préarrangements
<ol><li>Préparer 1 L de tampon de perfusion 10x (tableau 1), 500 mL de tampon de perfusion 1x (tableau 2), 50 mL de tampon de digestion (tableau 3), 10 mL de tampon stop (tableau 4), 1 L de solution Tyrode (tableau 5), 10 mL de chaque solution calcique (solution Tyrode avec glucose et quantité respective de calcium comme indiqué), 1 L de solution 4-AP (tableau 5), 100 mL de solution pour pipette (tableau 6) et 5 mL d’acide pluronique selon les recettes fournies. REMARQUE: Les solutions de bain (Tyrode et solution 4-AP) peuvent être préparées (sans glucose) à l’avance et stockées à +4 ° C, le glucose est ajouté le jour expérimental. La solution pour pipette peut être conservée à -20 °C, l’indicateur de calcium est ajouté le jour de l’expérimentation et la solution est ensuite stockée sur de la glace jusqu’à une utilisation ultérieure. Le tampon de perfusion 10x peut être stocké à température ambiante, le tampon de perfusion 1x, le tampon de digestion et le tampon d’arrêt doivent être fraîchement préparés le jour de l’expérience.</li>
	<li>Allumez le bain-marie et la pompe à rouleaux.</li>
	<li>Préremplir l’appareil Langendorff avec un tampon de perfusion; Assurez-vous qu’il est sans air.</li>
	<li>Préparer la canule aortique en la fixant au microscope à dissection, la connecter avec une seringue de 1 mL remplie de tampon de perfusion et purifier l’air en rinçant la canule. REMARQUE: Il est crucial d’éviter tout air à l’intérieur du système de perfusion, car cela affectera directement la perfusion coronaire et donc l’efficacité de la digestion. Un piège à bulles peut être ajouté à la configuration si nécessaire, pour éviter en toute sécurité tout piégeage d’air.</li>
	<li>Préparez des boîtes de Petri avec suffisamment de tampon de perfusion pour la collecte d’organes et la microscopie (le tampon doit couvrir solidement tout l’organe, quelques millilitres – en fonction de la taille de la boîte de Petri utilisée – devraient suffire).</li>
	<li>Préparez 3 boîtes de Petri avec un tampon de digestion pour la dissociation des tissus et la microscopie, le tampon doit couvrir l’organe pour la dissection au microscope dans la boîte de Petri respective, la quantité dépend de la taille de la boîte de Petri utilisée. Pour la dissociation, utilisez 3 mL pour le tissu ventriculaire et 1,5 mL pour le tissu auriculaire.</li>
</ol>2. Prélèvements d’organes
<ol><li>Injectez à la souris 0,1 mL d’héparine (1 000 U/mL) à l’aide d’une seringue de 1 mL avec une canule de 27 G et attendez 5 à 10 minutes.</li>
	<li>Placez la souris dans une chambre d’induction avec un petit tissu imbibé d’environ 500 μL d’isoflurane. L’animal ne doit pas être en contact avec le tissu. Pour éviter cela, on peut utiliser une cassette d’incorporation de biopsie plastique pour couvrir le tissu. Une fois que l’animal est complètement anesthésié, vérifiez le réflexe de pincement des orteils et dès qu’il n’est plus présent, euthanasiez rapidement la souris par luxation cervicale.</li>
	<li>Placez la souris sur une plate-forme sur le dos (par exemple, sur de la mousse de polystyrène recouverte d’une serviette en papier) et fixez les pattes avec des canules pour la maintenir en place.</li>
	<li>Enlevez la fourrure et la peau recouvrant la poitrine et une partie de l’abdomen avec une coupe claire du jugulum vers la symphyse et ouvrez l’abdomen juste sous la xiphoïde sans blesser la structure de l’organe à l’aide de ciseaux. Soulevez le sternum avec une pince chirurgicale et coupez le diaphragme avec des ciseaux le long du bord des côtes, puis coupez les côtes en ligne axillaire médiale et retirez la cage thoracique pour exposer le cœur.</li>
	<li>Retirez soigneusement le péricarde à l’aide d’une pince émoussée et retirez rapidement le cœur en le soulevant avec une pince émoussée par le bas et en coupant les gros vaisseaux d’une seule coupe à l’aide de ciseaux.</li>
	<li>Placez le cœur dans un tampon de perfusion à température ambiante et canulez l’aorte avec une aiguille émoussée au microscope le plus rapidement possible. REMARQUE: Enlevez tout tissu pulmonaire et tissu adipeux attaché à l’organe sans perdre trop de temps dessus. Pendant la canulation, assurez-vous que l’extrémité de l’aiguille ne s’étend pas à travers la valve aortique, car cela nuirait aux résultats en empêchant les tampons de pénétrer dans les artères coronaires.</li>
	<li>Attachez fermement le cœur avec un morceau de soie suturante à l’aiguille et débranchez-le de la seringue. REMARQUE: L’ensemble de la procédure depuis l’obtention du cœur (le moment où les gros vaisseaux sont coupés) jusqu’à la suture de l’aorte à l’aiguille devrait prendre le moins de temps possible. Il est recommandé de ne pas prendre plus de 90-180 s de retrait du cœur jusqu’au début de la perfusion.</li>
</ol>3. Digestion enzymatique
<ol><li>Après la canulation aortique, connectez immédiatement le cœur canulé à l’appareil de Langendorff en évitant que de l’air ne pénètre dans le système. REMARQUE: Il peut être utile d’avoir une goutte suspendue de tampon de perfusion au bas de l’appareil Langendorff ainsi qu’une goutte de tampon de perfusion sur le dessus de l’aiguille afin d’éviter que de l’air ne pénètre dans le système.</li>
	<li>Perfuser le cœur avec un tampon de perfusion pendant 1 min à une température d’exactement 37 °C et un taux de perfusion d’exactement 4 mL/min. NOTE: Pour avoir une température de 37 °C à l’extrémité de l’aiguille de perfusion, la température du bain-marie doit être réglée légèrement au-dessus à environ 40 °C. Cela doit être testé régulièrement en mesurant la température à l’extrémité de perfusion.</li>
	<li>Basculer la perfusion vers le tampon de digestion et la perfusible pendant exactement 9 minutes à une température d’exactement 37 °C et un taux de perfusion d’exactement 4 mL/min.</li>
	<li>Transférer le cœur digéré dans une boîte de Petri avec suffisamment de tampon de digestion pour le garder complètement couvert. Ensuite, disséquez soigneusement les oreillettes et les ventricules au microscope.</li>
	<li>Transférer les oreillettes dans une boîte de Petri avec 1,5 mL de tampon de digestion et les ventricules dans une autre boîte de Petri avec 3 ml de tampon de digestion.</li>
	<li>Dissection auriculaire<ol><li>Avec précaution, mais sans perte de temps, séparez les oreillettes en petits morceaux à l’aide de pinces émoussées.</li>
		<li>Dissoudre le tissu en pipetant soigneusement de haut en bas à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL, qui a déjà été coupée pour élargir l’ouverture de l’embout.</li>
		<li>Transférer la solution dans un tube à centrifuger de 15 mL et ajouter une quantité équivalente de tampon stop (1,5 mL) en pipetant soigneusement sur le côté du tube pour mettre fin à la réaction.</li>
		<li>Passez soigneusement les 3 mL de solutions cellulaires ou tissulaires à travers un filet de nylon de 200 μm pour enlever les gros morceaux de tissu restants qui n’ont pas été complètement digérés. REMARQUE: Une digestion réussie ne laissera presque pas de morceaux solides.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissection ventriculaire<ol><li>Hacher rapidement le tissu ventriculaire en petits morceaux à l’aide de ciseaux à dissection et pipette de haut en bas pour le dissoudre. Utilisez une autre pointe de pipette de 1 000 μL pour pipeter de haut en bas, elle peut être raccourcie pour élargir l’ouverture.</li>
		<li>Transférer la solution cellulaire/tissulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL et ajouter une quantité équivalente de tampon stop (3 mL) en pipetant soigneusement sur le côté du tube pour mettre fin à la réaction.</li>
		<li>Passez soigneusement les 6 mL de solution cellulaire ou tissulaire à travers un filet de nylon de 200 μm pour enlever les gros morceaux de tissu qui n’ont pas été complètement digérés. REMARQUE: Une digestion réussie ne laissera presque pas de morceaux solides.</li>
	</ol></li>
	<li>Laisser reposer les deux tubes (suspension de cellules auriculaires et ventriculaires) sur le banc à température ambiante pendant 6 min pour se déposer.</li>
	<li>Centrifuger les deux tubes de 15 mL à 5 x g pendant 2 min.</li>
</ol>4. Réintroduction du calcium
REMARQUE: Les étapes suivantes sont identiques pour les cellules auriculaires et ventriculaires (sauf indication contraire) et sont effectuées à température ambiante.
<ol><li>Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique et remettre soigneusement en suspension la pastille dans 10 mL de solution de Tyrode sans calcium.</li>
	<li>Laisser les cellules pendant 8 min pour la sédimentation.</li>
	<li>Centrifuger à 5 x g pendant 1 min (uniquement les cellules auriculaires, la sédimentation suffit pour les cellules ventriculaires).</li>
	<li>Jeter le surnageant et remettre soigneusement en suspension la pastille dans 10 mL de solution de Tyrode à concentration de calcium de 100 μM.</li>
	<li>Laisser les cellules pendant 8 min pour la sédimentation.</li>
	<li>Centrifuger à 5 x g pendant 1 min (uniquement les cellules auriculaires, la sédimentation suffit pour les cellules ventriculaires).</li>
	<li>Jeter le surnageant et remettre soigneusement en suspension la pastille dans 10 mL de solution Tyrode à une concentration de calcium de 400 μM.</li>
	<li>Laisser les cellules pendant 8 min pour la sédimentation.</li>
	<li>Centrifuger à 5 x g pendant 1 min (uniquement les cellules auriculaires, la sédimentation suffit pour les cellules ventriculaires).</li>
	<li>Jeter le surnageant et remettre délicatement la pastille en suspension dans 1 mL (auriculaire)/5 mL (ventrable) de solution Tyrode à concentration de calcium de 1 mM.</li>
</ol>5. Charge des myocytes avec l’indicateur de calcium fluorescent Fluo-3 AM
REMARQUE : En raison de la sensibilité à la lumière de l’indicateur de calcium fluorescent, les étapes suivantes doivent être exécutées à l’abri de la lumière (p. ex., en recouvrant les tubes avec du papier d’aluminium).
<ol><li>Préparer la solution mère de Fluo-3 AM en ajoutant 44 μL de F-127 pluronique à 20 % dans du DMSO anhydre à 50 μg de Fluo-3AM (peut être conservé à -20 °C à l’abri de la lumière).</li>
	<li>Ajouter 10 μL de solution mère de Fluo-3 AM à 1 mL de suspension cellulaire et incuber pendant 10 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Centrifuger à 5 x g pendant 1 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique et remettre en suspension la pastille dans une quantité raisonnable de solution de bain pour obtenir une bonne concentration de travail (1-5 mL de solution de bain selon la densité cellulaire).</li>
	<li>Laisser reposer 30 min pour la disestérification avant de commencer les expériences.</li>
</ol>6. Mesures simultanées de patch-clamp et d’épifluorescent Ca2+-transitoires comme décrit précédemment16
NOTE: Les mesures de pince patch ne sont pas le sujet de cet article, le lecteur intéressé peut être renvoyé aux principales publications fournissant des descriptions détaillées de cette méthode 17,18,19,20,21,22. Néanmoins, pour une meilleure compréhension globale, un résumé d’un protocole pour mesurer les courants de calcium de type L ainsi que les transitoires de calcium induits par le courant est fourni.
<ol><li>Transférer les myocytes dans une chambre cellulaire et superfuser avec une solution de bain à 37 °C.</li>
	<li>Bloquer les courants de potassium en ajoutant de la 4-aminopyridine et du chlorure de baryum à la solution du bain, comme indiqué dans le tableau 5.</li>
	<li>S’assurer que les microélectrodes borosilicatées ont une résistance à l’extrémité de 2 à 5 MΩ remplie de solution de pipette (tableau 6).</li>
	<li>Configurez les mesures pour permettre l’enregistrement simultané des signaux électriques et de l’épifluorescence en même temps. Le mode de serrage de tension est utilisé pour mesurer le courant Ca2+ de type L avec un protocole maintenant la cellule à -80 mV et une impulsion rampe de 600 ms à -40 mV pour inactiver le courant Na+ rapide, suivi d’une impulsion d’essai de 100 ms à +10 mV à 0,5 Hz (Figure 2).</li>
	<li>Utiliser l’excitation à 488 nm, la lumière émise à <520 nm pour détecter et convertir en [Ca2+]I en supposant <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61964/61964equ01.jpg"> Où kd = constante de dissociation de Fluo-3 (864 nM), F = fluorescence Fluo-3; Fmax = Fluorescence saturée enCa2+ obtenue à la fin de chaque expérience19.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Camm, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation:+the+Task+force+for+the+management+of+atrial+fibrillation+of+the+European+Society+of+Cardiology+(ESC).">Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task force for the management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> Europace. 12 (10), 1360-1420 (2010).</li><li>Chugh, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+epidemiology+of+atrial+fibrillation:+a+global+burden+of+disease+2010+study.">Worldwide epidemiology of atrial fibrillation: a global burden of disease 2010 study.</a> Circulation. 129 (8), 837-847 (2014).</li><li>Tonchev, I., Luria, D., Orenstein, D., Lotan, C., Biton, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+whom+the+bell+tolls+:+Refining+risk+assessment+for+sudden+cardiac+death.">For whom the bell tolls : Refining risk assessment for sudden cardiac death.</a> Current Cardiology Reports. 21 (9), 106 (2019).</li><li>Kirchhof, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2016+ESC+Guidelines+for+the+management+of+atrial+fibrillation+developed+in+collaboration+with+EACTS.">2016 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation developed in collaboration with EACTS.</a> European Heart Journal. 37 (38), 2893-2962 (2016).</li><li>Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antiarrhythmic+drugs+for+treatment+of+atrial+fibrillation.">New antiarrhythmic drugs for treatment of atrial fibrillation.</a> Lancet. 375 (9721), 1212-1223 (2010).</li><li>Heijman, J., Voigt, N., Carlsson, L. G., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+safety+assays.">Cardiac safety assays.</a> Current opinion in pharmacology. 15, 16-21 (2014).</li><li>Sch&#252;ttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atrial+fibrillation.">Animal models of atrial fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolating+atrial+cells+from+large+mammals+and+humans.">Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).</li><li>Jansen, H. J., Rose, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+atrial+myocytes+from+adult+mice.">Isolation of atrial myocytes from adult mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).</li><li>Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+isolation+and+culture+of+atrial+myocytes,+ventricular+myocytes,+and+non-myocytes+from+an+adult+mouse+heart.">Simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. 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B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2++transients+and+membrane+currents.">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> Journal of Visualized Experiment. (77), e50235 (2013).</li><li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+I(K,ACh)+channels+in+the+diseased+heart.">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated I(K,ACh) channels in the diseased heart.</a> Methods in Enzymology. 484, 653-675 (2010).</li><li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart.">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 1175-1191 (2012).</li><li>Trafford, A. W., D&#237;az, M. E., Eisner, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes.">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1915-1925 (2001).</li><li>Zimmerman, A. N., H&#252;lsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart.">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).</li><li>Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=With+or+without+Langendorff:+A+new+method+for+adult+myocyte+isolation+to+be+tested+with+time.">With or without Langendorff: A new method for adult myocyte isolation to be tested with time.</a> Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).</li><li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution,+contraction,+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts.">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).</li><li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart.">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experiment in Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li><li>Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+optical+action+potential+measurement+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Visual Experiment. , e61890 (2020).</li></ol>

Cet article fournit un moyen simple et fonctionnel d’obtenir des myocytes auriculaires et ventriculaires de haute qualité à partir de la même souris pour des études patch-clamp avec des enregistrements transitoires de calcium simultanés. La qualité des données obtenues dépend fortement de la qualité de l’isolement cellulaire. Comme mentionné ci-dessus, de nombreuses méthodes pour isoler les cardiomyocytes murins ont été décrites précédemment 9,10,11,12.<sup class="xr...

Les arythmies cardiaques sont courantes et constituent l’un des principaux défis actuels en matière de soins de santé, car elles touchent des millions de personnes dans le monde. Les arythmies sont associées à une morbidité et une mortalité élevées 1,2 et représentent la cause sous-jacente de la majorité des morts subites cardiaques3. Les options de traitement à jour ont amélioré la survie des patients, mais sont encore principalement des traitements symptomatiques plutôt que de cibler les mécanismes sous-jacents. Ainsi, ces traitements ont une efficacité limitée et peuvent fréquemment causer des effets secondaires graves 4,5,6. Une amélioration des options de traitement actuelles nécessite un aperçu de la physiopathologie sous-jacente, ce qui crée le besoin de modèles appropriés à étudier. Les modèles de petits animaux - et en particulier les modèles murins - jouent un rôle crucial dans la recherche sur l’arythmie car ils permettent d’étudier les mécanismes clés de l’arythmogenèse, par exemple l’impact génétique sur l’électrophysiologie cellulaire, la fonction des canaux ioniques ou la manipulation du calcium 7,8.
À cette fin, des cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires isolés en quantité et viabilité suffisantes sont nécessaires. Un large éventail d’approches d’isolement différentes pour obtenir des myocytes auriculaires et ventriculaires a déjà été décrit 9,10,11,12,13 et certains groupes ont présenté des données provenant de mesures simultanées du courant de type L et des transitoires de calcium induits par le courant de calcium à partir d’un courant auriculaire 14 ou ventriculaire 15 cardiomyocytes murins. Cependant, à notre connaissance, il n’existe aucune donnée disponible sur les mesures auriculaires et ventriculaires d’un animal. Les chercheurs se concentrent sur une grande variété de sujets allant de l’électrophysiologie à la protéomique, en passant par les études fonctionnelles telles que la contractilité cellulaire ou les interactions protéiques, la fonction mitochondriale ou la génétique – toutes nécessitant des cardiomyocytes isolés. De nombreux protocoles publiés n’ont donc pas été spécifiquement développés pour les études de patch clamp, ce qui a conduit à des rendements limités et à une qualité cellulaire insuffisante pour les études de patch clamp. Ainsi, les mesures simultanées de patch clamp et de calcium transitoires de cellules auriculaires et ventriculaires isolées d’un animal ne peuvent pas être effectuées avec des protocoles établis.
L’isolement des myocytes murins – en particulier auriculaires – pour les expériences de patch clamp reste difficile. Cet article fournit une méthode simple et rapide pour l’isolement de myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité via une perfusion de Langendorff à base d’enzymes rétrogrades, qui permet ensuite des mesures simultanées du courant membranaire net et des transitoires de calcium induits par le courant d’un animal. Cet article élabore un protocole pour l’isolement des myocytes auriculaires et ventriculaires dérivés de souris de type sauvage et de souris porteuses de mutations génétiques. Ce protocole peut être utilisé pour les souris mâles et femelles. L’isolement des myocytes et les images et les résultats représentatifs décrits ci-dessous ont été obtenus à partir de souris sauvages de type C57Bl/6 à l’âge de 6 (± 1) mois. Néanmoins, ce protocole a été utilisé avec succès pour des souris de différents âges allant de 2 à 24 mois avec différents génotypes. La figure 1 montre la configuration de l’isolement et un gros plan d’un cœur canulé pendant la perfusion enzymatique.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G cannula</td>
			<td>Servoprax</td>
			<td>L10220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminopyridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A78403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic cannula</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130163-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt surgical forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650915-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12133C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating heated water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>ME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS994177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disscetion scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS600124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-aspartat K+-salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F3715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-3 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate tris salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating coil</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>25.000 IE/5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>induction chamber</td>
			<td>CWE incorporated</td>
			<td>13-40020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jacketed heart chamber</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>130160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049360250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl x 6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh (200 &#181;m)</td>
			<td>VWR-Germany</td>
			<td>510-9527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pasteur pipette</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z331759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri-dishes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic Acid F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM597D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650908-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS700540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suturing silk</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NC9416241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z683531-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>86330</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of high quality murine atrial and ventricular myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and l-type calcium current

Les modèles murins jouent un rôle crucial dans la recherche sur l’arythmie et permettent d’étudier les mécanismes clés de l’arythmagénèse, y compris la fonction altérée des canaux ioniques et la manipulation du calcium. À cette fin, des cardiomyocytes auriculaires ou ventriculaires de haute qualité sont nécessaires pour effectuer des mesures patch-clamp ou pour explorer les anomalies de manipulation du calcium. Cependant, le rendement limité des cardiomyocytes de haute qualité obtenus par les protocoles d’isolement actuels ne permet pas les deux mesures chez la même souris. Cet article décrit une méthode pour isoler des myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité via une perfusion de Langendorff à base d’enzymes rétrogrades, pour des mesures simultanées ultérieures des transitoires de calcium et du courant de calcium de type L d’un animal. Des cœurs de souris sont obtenus et l’aorte est rapidement canulée pour éliminer le sang. Les cœurs sont ensuite perfusés dans un premier temps avec une solution sans calcium (37 °C) pour dissocier le tissu au niveau des disques intercalés, puis avec une solution enzymatique contenant peu de calcium pour perturber la matrice extracellulaire (37 °C). Le cœur digéré est ensuite disséqué en oreillettes et ventricules. Les échantillons de tissus sont coupés en petits morceaux et dissous en pipetant soigneusement de haut en bas. La digestion enzymatique est arrêtée et les cellules sont réintroduites progressivement aux concentrations physiologiques de calcium. Après chargement avec un indicateur Ca2+ fluorescent, des cardiomyocytes isolés sont préparés pour la mesure simultanée des courants de calcium et des transitoires. De plus, les pièges d’isolement sont discutés et des protocoles de patch-clamp et des traces représentatives de courants de calcium de type L avec des mesures transitoires de calcium simultanées dans les myocytes murins auriculaires et ventriculaires isolés comme décrit ci-dessus sont fournis.

Le rendement d’isolement est déterminé après la réintroduction du calcium en pipetant 10 μL de suspension cellulaire sur une lame de microscope. Plus de 100 cellules viables, en forme de bâtonnet, non contractantes/10 μL pour l’isolement de cellules auriculaires et plus de 1 000 cellules viables, en forme de bâtonnet, non contractantes/10 μL pour l’isolement des cellules ventriculaires sont considérées comme un rendement suffisant et sont couramment obtenues à l’aide de ce protocole. Les cellules auri...

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Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Les modèles murins permettent d’étudier les mécanismes clés de l’arythmogenèse. À cette fin, des cardiomyocytes de haute qualité sont nécessaires pour effectuer des mesures patch-clamp. Ici, une méthode pour isoler les myocytes auriculaires et ventriculaires murins via une perfusion de Langendorff à base d’enzymes rétrogrades, qui permet des mesures simultanées des transitoires de calcium et du courant de calcium de type L, est décrite.

Isolement de myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité pour des mesures simultanées des transitoires Ca2+ et du courant calcique de type L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

isolation-high-quality-murine-atrial-ventricular-myocytes-for

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

2.9K vues.  Ludwig-Maximilians University Munich (LMU). Les modèles murins permettent d’étudier les mécanismes clés de l’arythmogenèse. À cette fin, des cardiomyocytes de haute qualité sont nécessaires pour effectuer des mesures patch-clamp. Ici, une méthode pour isoler les myocytes auriculaires et ventriculaires murins via une perfusion de Langendorff à base d’enzymes rétrogrades, qui permet des mesures simultanées des transitoires de calcium et du courant de calcium de type L, est décrite.

Vidéo: Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

L&#39;isolement et la manipulation génétique des adultes pour les myocytes cardiaques imagerie confocale

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Recherche

Biologie

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolement et enregistrements Chaîne Kv en cardiomyocytes murins auriculaire et ventriculaire

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

Isolation des myocytes auriculaires humaines pour la mesure simultanée de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitoires et courants membranaires

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Mesures de calcium cytosolique dans les cellules épithéliales rénales par cytométrie en flux

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tension et calcium double cartographie de canal optique de Cultured HL-1 auriculaire myocytes monocouche

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Développement et caractérisation de<em&gt; In vitro</em&gt; Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de l&#39;endothélium [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Et production d&#39;oxyde nitrique

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

Isolation simultanée de cardiomyocytes de haute qualité, de cellules endothéliales et de fibroblastes d&#39;un coeur de rat adulte

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

Surveillance de la libération de calcium ER / SR avec le Ca ciblé<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor CatchER<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...