Este es el primer protocolo que permite que el tejido mamario humano se mantenga vivo ex vivo durante períodos prolongados de tiempo, lo que permite directamente el estudio de las interacciones entre el tejido mamario humano y el cáncer de mama humano. La principal ventaja de esta técnica es que permite que las piezas macroscópicas de tejido mamario humano, incluidos los adipocitos mamarios, las células inmunes, las estructuras vasculares, las estructuras ductales y la matriz extracelular, se mantengan vivas ex vivo. Esta técnica tiene implicaciones importantes para varias áreas de la investigación del cáncer de seno incluyendo la medicina personalizada, el desarrollo farmacéutico y la patofisiología de la iniciación del tumor y de los procesos más lentos del cáncer de seno tales como fibrosis y remodelación extracelular de la matriz.
Demostrando este procedimiento son Katherine Hebert, un estudiante graduado de Tulane y Rakesh Gurrala un estudiante de medicina de Tulane de mi laboratorio. Para empezar, derrita la solución de gelatina preparada en un baño de agua de 37 grados Centígrados. Utilice una pipeta serológica de cinco o 10 mililitros para dispensar 2,5 mililitros de esta solución en cada émbolo para los pozos de una placa de seis pozos.
Una vez que la gelatina se haya solidificado, mueva las placas ASC codificadas pNIPAAm al gabinete de bioseguridad. Coloque suavemente los émbolos en los pozos de estas placas para que la gelatina entre en contacto con los ASC. Coloque una arandela de metal en el émbolo para pesarlo de modo que la gelatina esté en contacto directo con la hoja de ASC durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Mueva suavemente la placa con los émbolos en la caja estéril en el gabinete de bioseguridad y coloque la tapa sobre ella. Mueva la caja a una nevera de cuatro grados o coloque la placa sobre hielo y un cubo de hielo en el gabinete de bioseguridad durante 30 minutos. En un gabinete de bioseguridad, lave el tejido mamario humano tres veces con 10 mililitros de PBS estéril.
Use fórceps estériles y una cuchilla de afeitar para picar toscamente el BC-MPS y trate de eliminar la mayor cantidad posible de fascia y tejido conectivo. Una vez que el tejido conectivo ha sido eliminado utilizar una cuchilla de afeitar estéril para finalmente picar el tejido hasta que tenga una consistencia líquida homogénea. Corte la punta de una punta de pipeta P1000 para ayudar a pipetear el tejido picado.
En un tubo de 1,5 mililitros, combine el tejido picado, las líneas celulares de cáncer y los medios BC-MPS como se describe en el manuscrito del texto. Mueva la placa ACS que se utilizará para la lámina de celda inferior de la incubadora al gabinete de bioseguridad y aspire el medio de la placa. Pipetee la mezcla de tejido mamario preparado en el centro del pozo de la placa acs inferior utilizando la punta de la pipeta cortada, mueva la caja que contiene la placa ACS superior con émbolos al gabinete de bioseguridad.
Retire suavemente los émbolos de gelatina de la placa recubierta de pNIPAAm y colóqueles sobre la mezcla de tejidos. Agregue medios BC-MPS al pozo y mueva cuidadosamente las placas ACS inferiores con la mezcla BC-MPS y los émbolos a la caja de plástico estéril. Coloque la tapa de la caja para el transporte, teniendo cuidado de evitar la contaminación de la cultura.
Incubar la placa inferior en la caja y la incubadora de 37 grados Celsius hasta que la gelatina se derrita y la capa superior de ACS haya comenzado a adherirse a la capa inferior. Luego mueva la caja con las placas al gabinete de bioseguridad, retire suavemente los émbolos de las placas inferiores para observar el tejido con las células cancerosas ancladas al fondo del pozo. Coloque la tapa de la placa de seis pozos de nuevo en la placa inferior e incube a 37 grados para fundir completamente la gelatina y permitir que la capa superior se ancle a la capa inferior.
Mueva suavemente las placas a un gabinete de bioseguridad y aspire el medio desde el borde del pozo con una pipeta serológica de 10 mililitros. Agregue dos mililitros de medios frescos en el borde de cada pozo para evitar desalojar el tejido. Mantenga el BC-MPS a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante el período de tiempo deseado.
Cambiar los medios de comunicación cada dos o tres días. Mueva la placa al gabinete de bioseguridad cuando el BC-MPS esté listo para ser analizado. Retire los medios con una pipeta serológica para evitar el despreocupamiento accidental de cualquier tejido.
Agregue un volumen de PBS a cada pozo. A continuación, retire el PBS con una pipeta serológica. Agregue un mililitro de solución de disociación celular a cada pozo y mueva la placa de vuelta a la incubadora durante cinco minutos para permitir que estas células se desprencien.
Después de la incubación, use un raspador de células para separar completamente las células y el tejido de la placa de cultivo en un gabinete de bioseguridad. Transfiera la solución con el tejido a un tubo cónico de 15 mililitros y recoja las células restantes agregando dos mililitros de PBS. Envuelva el tubo con papel de aluminio si las células son fluorescentes.
Incubar el tubo a 37 grados bajo agitación constante en una coctelera orbital a la vez G durante 10 a 20 minutos para disociar completamente las células del tejido. En un gabinete de bioseguridad, use una pipeta serológica para interrumpir cualquier grupo restante de células en el tubo. Y filtre la muestra a través de un colador de tejido de 250 micro metros en un nuevo tubo de 15 mililitros.
Enjuague el colador con un mililitro de PBS para recoger las células restantes. Centrifugar las muestras a 500 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos para separar los adipocitos que estarán flotando en la capa superior de las células cancerosas y ascs mezclados en un pellet. Transfiera la capa de adipocitos a un nuevo tubo usando una punta de pipeta de corte romo.
Centrifugar la muestra de nuevo y utilizar una jeringa y una aguja para extraer la solución restante de debajo de los adipocitos. Aspirar la solución restante del tubo que contiene los ASC y las células cancerosas sin interrumpir el pellet celular. Vuelva a suspender el pellet en medios PBS o BC-MPS y utilice citometría de flujo para clasificar las células en función de la fluorescencia.
El patrón stri-aided de la hoja confluente de ASC se muestra aquí. El tejido humano boyante del pecho seguía siendo estable anclado por las hojas de la célula del ASC al fondo del pozo después de 14 días de cultura. Las imágenes fluorescentes de la microscopia demuestran la estabilidad del BC-MPS con MDA-MB-231 que expresa variedades de células de RFP después de 14 días y con el explant triple negativo PDX del tumor por lo menos seis días.
BC-MPS que contenía tejido mamario se cultió in vitro durante 14 días, se manchó y se tiñeron la imagen para demostrar los elementos nativos del tejido a una ampliación de 100X y 20X. La coloración de los marcadores del macrófago fue utilizada para demostrar la preservación de macrófagos primarios después de tres y siete días en cultura. El análisis cytometry de flujo de las células manchadas Bodipy MDA-MB-231 después de 14 días indica la acumulación mínima del lípido en cultura 2D y la acumulación extensa del lípido y BC-MPS.
La proporción de células positivas MDA-MB-231 del lípido era el doblez 26,2 mayor en BC-MPS que la cultura 2D. Las células cultivadas en BC-MPS exhibieron las gotitas del lípido del aumento comparadas a las células cultivadas en cultura 2D estándar. Las imágenes del lapso de tiempo de RFP etiquetaron BC-MPS con las células MDA-MB-231 demostraron el movimiento ameboide de 231 células con las pseudo vainas y la alta movilidad.
El tejido mamario debe ser picado lo suficientemente pequeño y separado lo suficiente como para ser distribuido a través de la parte inferior del pozo. El tejido mamario es muy boyante y si las piezas son demasiado grandes o se agrupan demasiado juntas, las láminas celulares de ASC no podrán anclar el tejido mamario al fondo del pozo. Las construcciones resultantes del cáncer del tejido del pecho pueden experimentar la digestión enzimática para aislar tipos particulares de la célula de interés.
Esto permitirá responder a preguntas clave como la forma en que las células cancerosas en el tejido mamario responden de manera diferente a la quimioterapia en comparación con el cultivo 2D tradicional o los organoides.
