Este método utiliza la diversa manera de abordar los desafíos de expresión de proteínas virales recombinantes utilizando una proteína viral P'as una chaperona para otra proteína viral N'para obtener proteínas N libres de ARN. La proteína N del RSV libre de ARN se obtiene antes de ensamblar el ARN específico del virus en nucleocáppsida in vitro. El método también se puede utilizar con otros virus de ARN de sentido negativo no segmentados.
El método de clonación independiente de la ligadura es una técnica rápida para adquirir construcciones de coexpresión. ¿Por qué o electivas manchan el microscopio electrónico es un método rápido para comprobar el montaje grande en la célula cruda. Queremos darte dos consejos.
Primero, obtenga resultados sólidos y de alto rendimiento para cada paso antes de pasar al siguiente paso. En segundo lugar, establezca programas adecuados para la cromatografía y practique la recolección de rejillas con tórceps. Para la construcción bi-cistrónica de la co-expresión N y P, cultivar cuatro cultivos de un litro de células de cepa E coli BL21DE3 en medio LB a 37 grados Celsius.
Cuando la densidad óptica a 600 nanómetros alcance los 0,6, baje la temperatura a 16 grados centígrados. Después de una hora, induzca la expresión de proteínas mediante tratamiento con 0,5 milimolares IPTG durante la noche. A la mañana siguiente, recoger las células por centrifugación y resuspend los pellets en 200 mililitros de tampón de lisis.
lyse las células por sonicación durante 15 minutos, con tres segundos en, tres segundos de pulsos. Y recoger los lysates por centrifugación. Cargue el sobrenadante en una columna de gravedad de cobalto de 2,5 por 10 centímetros, con aproximadamente 10 mililitros de perlas.
Preequilibrado con volúmenes de 5 a 10 columnas de búfer de lisis. Y lave la columna con cinco volúmenes de columna de tampón B y cinco volúmenes de tampón C.Use dos volúmenes de tampón D para eluir la proteína de las perlas. Y equilibre la columna Q con cinco volúmenes de un mililitro de búfer de control de calidad.
Utilice una bomba peristáltica para cargar la muestra diluida en la columna. Derrita la columna Q cargada en la máquina de HPLC, junto con los búferes de control de calidad y QB frescos. Ejecute el lavado de la bomba para lavar con éxito la máquina con uno o dos volúmenes de búferes QB y QA.
Después del último lavado, establezca el caudal en un mililitro por minuto y establezca UV1 en 280 nanómetros y UV2 en 260 nanómetros, utilizando una placa de pozo de 96 profundidades para recoger las fracciones. A continuación, utilice una aplicación de gradiente escalonado de tres a cuatro volúmenes de cada concentración de agente de elución para eluir las proteínas, comenzando con una concentración de 0% QB y aumentando el porcentaje en un 5% cada vez. El complejo de la proteína de N-0 P elute en la concentración del almacenador intermediario del 15%QB.
Aislar la proteína por filtración de gel, en una columna de purificación a pequeña escala de uno por 30 centímetros, equilibrada con tampón E.A continuación, analizar la proteína que contiene fracciones por sds página. Para el ensamblaje de nucleocápsides específicas del virus, mezcle e incube el complejo purificado N-0 P con RNA oligo a una relación molecular de 1:1.5 a temperatura ambiente durante una hora. Preequilibrar una columna de filtración de gel de purificación a pequeña escala con tampón E.Y eliminar cualquier precipitación por centrifugación.
Cargue el sobrenadante, a la columna de cromatografía de exclusión de tamaño. Y compare las imágenes de cromatografía de exclusión de tamaño de la proteína con el ensamblaje de ARN, y las muestras de control de proteína sola, combinando las relaciones de pureza de ácidos nucleicos, para identificar qué picos son el ARN N ensamblado, N-0 P y ARN libre. Para ensamblar un complejo de ARN N, recoja todas las fracciones máximas de ARN N, realice una extracción de ARN y ejecute un gel de página de urea para verificar la longitud del ARN específico.
Para preparar una rejilla de tinción negativa para microscopía electrónica de manchas negativas, use una placa de calor para calentar 5 mL de agua destilada doble a ebullición y agregue 37.5 miligramos de formiato de uranilo al agua para obtener una solución de tinción de formiato de uranilo al 0.75%. Transfiera la solución a un beaker cubierto de papel de aluminio. Y añadir cuatro microlitros de 10 molares de hidróxido de sodio.
Después de 15 minutos de agitación protegidos de la luz, filtre la solución a través de un filtro de 0,22 micras en un tubo de ensayo. Para hacer que las rejillas de microscopía electrónica recubiertas de carbono continuo sean hidrofílicas, coloque las rejillas en una cámara conectada a una fuente de alimentación y aplique iones cargados negativamente a las redes. Corte y doble una tira de parafilm de dos por dos pulgadas.
Agregue dos gotas de 40 microlitro de agua destilada a un extremo de la tira. Y dos 40 gotas de microlitro de 0.75% solución de tinción de formiato de uranilo en el otro extremo. Agregue tres microlitros de muestra de proteína a cada cuadrícula.
Después de un minuto, bloquee las rejillas contra el papel secante y sumerja las rejillas dos veces en las gotas de agua destiladas. Y una vez en la primera gota de solución de tinción. Luego sumerja la rejilla en la segunda gota de la solución de tinción durante 30 segundos, antes de borrar las rejillas contra el papel secante para eliminar cualquier exceso de solución de manchas y permitir que las rejillas se sequen al aire antes de la toma de imágenes.
Usando este protocolo, un complejo sincitial respiratorio hetero dimérico soluble en grande del virus N0 P puede ser obtenido. En E coli, la longitud completa de las porciones N y N-terminales de las proteínas P se co-expresan con una etiqueta 10 X His en la proteína N. De acuerdo con el ratio del ácido nucleico de la absorbancia ULTRAVIOLETA, N0 P contuvo la longitud completa N y el N-terminal P, pero no contuvo el ARN celular.
El N0 P purificado podría entonces ser estimulado y ensamblado en nucleópsidas como partículas en rejillas de microscopía electrónica vía la incubación con oligos específicos del ARN según lo demostrado. Al purificar la proteína evitar burbujas de aire durante la purificación de la columna y diluir la muestra con tampón de QA para ajustar el pH y la concentración de sal antes de cargar la muestra en la columna. Tenga cuidado de mantener las rejillas de microscopía electrónica en el borde exterior para evitar contaminar las rejillas.
Esto nos ayudará a determinar las preguntas no positivas del empaquetamiento del genoma del RSV, si se trata de la estructura helicoidal zurda o derecha. Siguiendo esos procedimientos y auténticos se puede realizar una plantilla de ARN para el ensayo de actividad de la POLIMERASA del RSV. Y esta nucleocáppsida específica viral del VR se puede utilizar para el análisis crio EM de alta resolución.
