Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cómo se activan los glóbulos blancos, y cómo se desarrollan las alergias a los alérgenos individuales? La principal ventaja de este modelo de ratón de alergia robusto y reproducible es que se pueden utilizar menos ratones para producir una menor varianza con una población experimental. Las nuevas inmunoterapias para controlar las respuestas inmunitarias requieren modelos robustos de ratón como medio inicial de pruebas de eficacia in vivo.
Por lo tanto, las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la inmunoterapia para alergias. Aunque este método puede proporcionar información sobre las alergias, también se puede aplicar a otros sistemas, como la autoinmunidad en la que las respuestas de anticuerpos no deseados juegan un papel clave en la enfermedad. Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán debido a la falta de experiencia en el trabajo con nanopartículas liposómicas o una inexperiencia con las técnicas requeridas en el trabajo del ratón.
Comience añadiendo 2,5 molar equivalentes del reticulante heterobifuncional a la proteína y colocando la reacción en una coctelera oscilante a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora. Después de una incubación de una hora con SPDP, desalar la proteína en una columna equilibrada en acetato de sodio de 100 milimolares, y recoger las fracciones. Determine la absorbancia de 280 nanómetros y acote las fracciones superiores.
Lave la columna en PBS y agregue ditiothreitol de 25 milivotroles, o TDT, a las fracciones de proteínas agrupadas para una incubación de cinco a 10 minutos. A continuación, mida las absorbancias de 280 y 343 nanómetros de la proteína para permitir el cálculo de la relación de vinculación basada en la molaridad de la proteína y el vinculador. A continuación, ejecute las fracciones agrupadas de la columna lavada por PBS y recopile las fracciones para la medición de la agrupación de 280 nanómetros y fracción superior como se ha demostrado.
Añadir el volumen adecuado de 100x DSPE-PEG2000-Maleimida a la proteína para lograr una concentración final de 1x, 10 veces en exceso molar con suave remolino. A continuación, ejecute la reacción durante la noche bajo nitrógeno en un matraz de fondo redondo sellado. Al día siguiente, ejecuta la proteína sobre una columna de gotas de gel de dextrano reticulada y almacena las fracciones finales agrupadas de proteína ligada a lípidos a cuatro grados centígrados hasta su uso.
Una vez calculada la cantidad correcta de cada lípido, combine todos los lípidos en un tubo de ensayo de vidrio borosilicato de 12 mililitros, y utilice una jeringa y un tubo de tres mililitros para soplar cuidadosamente el cloroformo con nitrógeno. A continuación, liofilice la solución con 100 microlitros de DMSO durante la noche. A la mañana siguiente, agregue un mililitro de proteína ligada a lípidos al tubo lipídico de 12 mililitros, y sonice la solución de tres a cuatro veces durante 30 a 60 segundos por sonicación en un baño de agua de sonicación con descansos de al menos cinco minutos entre sonicaciones.
Después de la última sonicación, cargue la muestra en una de las jeringas extrusoras colocadas en el extrusor y coloque la jeringa del extrusor en el otro extremo del extrusor. La jeringa vacía se llenará a medida que el lípido se extruya a través de la membrana de policarbonato de 0,8 micrómetros. Coloque el extrusor completamente montado en un bloque de calentamiento y presione suavemente el émbolo para vaciar la jeringa.
Después de la última extrusión, transfiera los liposomas a un vial limpio, y extruya los lípidos a través de membranas de policarbonato 0.2 y 0.1-micrometer como se acaba de demostrar. Luego, almacene los liposomas en cuatro grados Centígrados. Para controlar la respuesta de las células B a la activación de liposomas antigénicos, resuspender 1,5 veces 10 a los séptimos esplenocitos en el tampón de carga de flujo de calcio, y añadir 1,5 micromolar Indo-1 a las células, invirtiendo la solución en el tubo varias veces para mezclar.
Después de una incubación de baño de agua de 30 minutos a 37 grados Centígrados, protegida de la luz, agregue cinco veces el volumen de tampón de carga de flujo de calcio y centrifugar las células etiquetadas por Indo-1. Para el gating de células B, las células de tinción con anticuerpos anti-CD5 y anti-B220 en 0,5 mililitros de tampón de carga a cuatro grados Centígrados durante 20 minutos, protegidos de la luz. Al final de la incubación, lave las células en el tampón de carga de flujo de calcio fresco, y resuspendir el pellet en una a dos veces 10 a las séptimas células por mililitro de flujo de calcio fresco que corre tampón para su almacenamiento en hielo, protegido de la luz hasta el análisis.
A continuación, agregue 0,5 mililitros de células a un tubo de poliestireno con tapa, cinco mililitros, fondo redondo, y caliente las células a 37 grados centígrados en un baño de agua. Después de tres a cinco minutos, transfiera el tubo a una cámara con camisa de agua de 37 grados Celsius conectada a un baño de agua recirculante, y ejecute el tubo en la chaqueta de agua en el citometro de flujo. Después de recopilar de 5.000 a 10.000 eventos por segundo, permita que las celdas se estabilicen durante 15 a 30 segundos y reinicie la adquisición de datos, recopilando los datos durante al menos 10 segundos para establecer una lectura de fondo.
En la marca de 10 segundos, retire rápidamente el tubo del citometro de flujo y agregue la concentración experimental adecuada de liposomas antigénicos. Luego, pulse el vórtice de las células, y lea el tubo en el citómetro durante tres a cinco minutos adicionales. Para sensibilizar a los animales, entregar 200 microlitros de extracto de cacahuete que contienen toxina del cólera a través de gavage oral a cada receptor de ratón hembra BALB/c de cuatro a cinco semanas de edad una vez a la semana durante tres semanas durante tres semanas y 300 microlitros de extracto de cacahuete diluido en la cuarta semana.
En el día 28, preparar el extracto de cacahuete a una concentración final de un miligramo por mililitro en PBS, y utilizar un termómetro rectal para medir la temperatura corporal basal de cada animal sensibilizado. Cuando se hayan medido todas las temperaturas, administre 200 microlitros de extracto de cacahuete a cada receptor a través de la inyección intraperitoneal, y mida la temperatura corporal con el termómetro rectal cada 15 minutos durante una hora después de la inyección. Un chapuzón en la temperatura corporal indica una alergia al maní.
Después de aislar los esplocitos de los ratones alérgicos al maní, utilice una jeringa de insulina de un mililitro equipada con una aguja de 27 calibres y 5/8 pulgadas para inyectar por vía intravenosa 1,5 veces 10 en el séptimo de los esplenocitos alérgicos extraídos en las venas de la cola de animales ingenuos y no aislados. Un día después de la transferencia adoptiva, inyectar por vía intravenosa 200 microlitros de Ara h 2 liposomas antigénicos en la vena de la cola de cada ratón BALB/c que recibió los espleocitos alérgicos. Dos semanas después de la inyección de liposomas, aumentar los ratones con una i.p.
inyección de Ara soluble h 2, seguido de un desafío de 200 microlitrotros Ara h 2 el día 61. A continuación, mida las temperaturas corporales con la sonda rectal cada 15 minutos como se ha demostrado. La conjugación de proteínas se puede demostrar ejecutando un gel reductor que muestra un aumento en el peso molecular en comparación con la proteína no conjugada.
Para evaluar el flujo de calcio de células B estimulado por liposomas antigénicos, compuerte las células individuales vivas para permitir la selección de las células B CD5 negativas B positivas B220-positivas. La proporción de violeta Indo-1 frente a fluorescencia azul Indo-1 a lo largo del tiempo se puede analizar para evaluar la cantidad de activación de células B inducida por liposomas. La cuantificación de Ara h 2-specific IgE e IgG1 en el suero de ratones sensibilizados con extracto de cacahuete por ELISA indica que los ratones con sensibilidad conferida que se potencian con Ara h 2 exhiben IgE e IgG1 específicos de Ara h 2 mensurables en su suero.
Las temperaturas corporales registradas durante el desafío Ara h 2 revelan que los ratones alérgicos demuestran una disminución de las temperaturas corporales después del desafío, mientras que las temperaturas corporales en ratones ingenuos siguen siendo constantes. Al intentar este procedimiento, es importante recordar cuidadosamente realizar un seguimiento de la cantidad de proteína ligada a los lípidos que se incorpora en los liposomas, ya que demasiada proteína puede dificultar la extrusión. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el seguimiento y clasificación de células B y T específicas de alérgenos para responder preguntas adicionales sobre cómo estas células específicas de alérgenos responden a las terapias.
Esta técnica allanará el camino para que los investigadores del campo de la alergia exploren nuevas inmunoterapias que combaten la enfermedad alérgica utilizando este modelo de ratón. No olvide que trabajar con toxina del cólera puede ser peligroso y que las pautas para su uso deben seguirse de acuerdo con sus normas institucionales locales de seguridad biológica.
