Este protocolo tem muitas vantagens sobre a metabolômica de levedura atualmente utilizada porque tem alta especificidade, alta sensibilidade, e também pode traçar muitas classes diferentes de metabólitos, incluindo moléculas isomericas, isobáricas, hidrofílicas e hidrofóbicas. O método de saciamento utilizado neste protocolo interrompe todas as reações enzimáticas, ao mesmo tempo em que reduz significativamente o vazamento de metabólitos das células. A biblioteca MS1 construída neste protocolo é das várias corridas MS2.
Após a cultura da noite a 30 graus Celsius e 200 revoluções por minuto, determine o número de células de levedura por mililitro de cultura e adicione cinco mililitros de solução de 20% de glicose esterilizadas a cada um dos dois frascos erlenmeyer contendo 45 mililitros de YP médio autoclaved por frasco. Use uma pipeta de transferência estéril para adicionar cinco vezes 10 às sétimas células de levedura a cada frasco e cultivar as células de levedura por pelo menos 24 horas adicionais a 30 graus Celsius a 200 revoluções por minuto. Para extração metabólito, após cultura, colete as células de levedura por centrifugação e remova rapidamente o sobrenatário.
Coloque o tubo em gelo seco e adicione dois mililitros de menos 20 graus Celsius clorofórmio, um mililitro de menos 20 graus Celsius metanol, um mililitro de água pura nano pura gelada, e 200 microlitres de 425 a 600 micron ácido lavado contas de vidro para as células. Quando as contas tiverem sido adicionadas, coloque o tubo coberto com papel alumínio em um kit portador de tubo de espuma com um retentor e vórtice a amostra por 30 minutos a velocidade média a quatro graus Celsius para facilitar a extração metabólito. Em seguida, incubar o tubo por 15 minutos no gelo antes de centrifugar a amostra para permitir a separação da fase aquosa superior dos detritos médios e proteínas e fases orgânicas inferiores.
Use uma micropipette para transferir aproximadamente 400 microliters da fase aquosa superior para um tubo lavado e rotulado de 1,5 mililitro contendo 800 microliters de menos 20 graus Celsius acetonitrilo. Em seguida, centrifugar a amostra e transferir 800 microliters da porção superior do supernatante para um frasco de espectrometria de massa rotulado para armazenamento em grau zero até a análise de espectrometria de massa cromatografia líquida tandem. Para separar os metabólitos extraídos, ultrassonós o frasco amostral por 15 minutos, seguido por três vórtices de 10 segundos à temperatura ambiente.
Após o vórtice, coloque o frasco na placa do poço do cromatógrafo líquido e coloque a coluna a 45 graus Celsius com uma taxa de fluxo de 0,25 mililitros por minuto e a placa do poço a zero graus Celsius. Em seguida, use a tabela para definir os gradientes de cromatografia líquida para a análise. Após a separação, utilize 10 volumes amostrais de microliter da injeção nos modos de ionização eletrospray positivo e negativo em um espectrômetro de massa equipado com ionização de eletropray aquecida para identificar e quantificar os metabólitos solúveis em água.
Ao final da análise, abra os dados brutos em um programa de software de análise composta apropriado e utilize a biblioteca de fragmentação espectral em massa para combinar com o espectro de massa para anotar os metabólitos identificados na análise. As massas exatas dos padrões ms1 e isótopos também podem ser identificadas para permitir a anotação dos metabólitos usando bancos de dados on-line. Em seguida, use a biblioteca de bancos de dados e espectros para procurar os espectros MS2 dos dados brutos.
No dia seguinte, depois de saciar as células de levedura, lave minuciosamente as células com 15 mililitros de tampão ABC e colete as células por centrifugação. Resuspenja a pelota em um mililitro de tampão ABC fresco e adicione 500 microliters da solução de iodeto de propídio às células. Vórtice a amostra três vezes por 10 segundos por vórtice e incubar as células por 10 minutos no gelo protegido da luz.
No final da incubação, colete as células por centrifugação e lave as células três vezes com um mililitro de tampão ABC fresco por lavagem. Após a última lavagem, resuspenja a pelota em 300 microlitros de tampão ABC fresco e adicione 10 microlitros da suspensão celular resultante a um slide de microscópio. Use um microscópio de fluorescência para capturar imagens de microscopia de interferência diferencial e microscopia de fluorescência das células com os filtros definidos para um comprimento de onda de excitação de 593 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 636 nanômetros.
Em seguida, use um programa apropriado de análise de imagem para contar o número total de células nas imagens de campo brilhante e fluorescência, e para determinar a intensidade da fluorescência da coloração para células individuais. O método de saciamento celular modificado causa danos significativamente menores à membrana plasmática e à parede celular do que o método de extinção de 80% de metanol não tamponado a menos 40 graus Celsius. De fato, quase todas as células submetidas à extinção usando o método modificado exibem emissão de fluorescência vermelha, característica das células de levedura em que a membrana plasmática e a parede celular não são danificadas.
Em contraste, quase todas as células submetidas à saciedade usando o método não tamponado de 80% de metanol a 40 graus Celsius apresentaram emissão de fluorescência verde, característica das células de levedura em que a membrana plasmática e a parede celular são significativamente danificadas. O método de saciamento de células modificadas também causa um vazamento significativamente menor de metabólitos solúveis em água de células de levedura do que o método de extinção de 80% de metanol não tamponado a menos 40 graus Celsius. Os valores de mudança de tempo de retenção dos padrões metabólitos solúveis em água são significativamente mais baixos e as formas de pico são substancialmente mais nítidas para a coluna de fase zwitteriônica em comparação com a coluna de fase inversa.
Outra vantagem do método de espectrometria de massa da cromatografia líquida tandem é a capacidade de usar a coluna de fase zwitteriônica para separar eficientemente diferentes metabólitos solúveis em água com diversas propriedades estruturais, físicas e químicas. Certifique-se de fazer o iodeto propidium em pé no escuro e também certifique-se de coletar a fase superior sem perturbar a fase média. Se qualquer MSP não puder ser anotado devido à falta da biblioteca espectral MS2, use uma RMN para ilustrar essa estrutura.
