Dieses Protokoll hat viele Vorteile gegenüber der derzeit verwendeten Hefemetabolomik, da es eine hohe Spezifität, eine hohe Sensitivität und viele verschiedene Klassen von Metaboliten profilieren kann, einschließlich isomerer, isobarer, hydrophiler und hydrophober Moleküle. Die in diesem Protokoll verwendete Abschreckmethode stoppt alle enzymatischen Reaktionen und reduziert gleichzeitig das Austreten von Metaboliten aus den Zellen erheblich. Die in diesem Protokoll integrierte MS1-Bibliothek stammt aus den verschiedenen MS2-Läufen.
Nach der Nachtkultur bei 30 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute bestimmen Sie die Anzahl der Hefezellen pro Milliliter Kultur und fügen Sie fünf Milliliter sterilisierte 20% ige Glukoselösung zu jedem der beiden Erlenmeyerkolben hinzu, die 45 Milliliter autoklaviertes YP-Medium pro Kolben enthalten. Verwenden Sie eine sterile Transferpipette, um fünfmal 10 zu den siebten Hefezellen in jeden Kolben zu geben und die Hefezellen für mindestens 24 zusätzliche Stunden bei 30 Grad Celsius bei 200 Umdrehungen pro Minute zu züchten. Für die Metabolitenextraktion sammeln Sie nach der Kultur die Hefezellen durch Zentrifugation und entfernen Sie schnell den Überstand.
Legen Sie das Röhrchen auf Trockeneis und geben Sie zwei Milliliter minus 20 Grad Celsius Chloroform, einen Milliliter minus 20 Grad Celsius Methanol, einen Milliliter eiskaltes Nano-Reinwasser und 200 Mikroliter 425 bis 600 Mikrometer säuregewaschene Glasperlen in die Zellen. Wenn die Perlen hinzugefügt wurden, legen Sie das mit Aluminiumfolie bedeckte Röhrchen in ein Schaumrohrhalter-Kit mit einem Retainer und wirbeln Sie die Probe für 30 Minuten bei mittlerer Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius, um die Metabolitenextraktion zu erleichtern. Als nächstes inkubieren Sie das Röhrchen für 15 Minuten auf Eis, bevor Sie die Probe zentrifugieren, um die Trennung der oberen wässrigen Phase von den mittleren Trümmern und Protein- und unteren organischen Phasen zu ermöglichen.
Verwenden Sie eine Mikropipette, um etwa 400 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in ein gewaschenes und markiertes 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 800 Mikrolitern von minus 20 Grad Celsius Acetonitril zu übertragen. Zentrifugieren Sie dann die Probe und übertragen Sie 800 Mikroliter des oberen Teils des Überstands in eine markierte Massenspektrometrie-Durchstechflasche zur Null-Grad-Lagerung bis zur Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse. Um die extrahierten Metaboliten zu trennen, ultraschallen Sie die Probenfläschchen für 15 Minuten, gefolgt von drei 10-Sekunden-Wirbeln bei Raumtemperatur.
Nach dem Wirbeln die Durchstechflasche in die Bohrplatte des Flüssigkeitschromatographen legen und die Säule auf 45 Grad Celsius mit einer Durchflussrate von 0,25 Millilitern pro Minute und die Bohrplatte auf null Grad Celsius einstellen. Verwenden Sie dann die Tabelle, um die Flüssigkeitschromatographie-Gradienten für die Analyse einzustellen. Verwenden Sie nach der Trennung 10 Mikroliter Probenvolumina der Injektion sowohl im positiven als auch im negativen Elektrospray-Ionisationsmodus in einem Massenspektrometer, das mit beheizter Elektrospray-Ionisation ausgestattet ist, um die wasserlöslichen Metaboliten zu identifizieren und zu quantifizieren.
Öffnen Sie am Ende der Analyse die Rohdaten in einem geeigneten Softwareprogramm für die Verbindungsanalyse und verwenden Sie die Bibliothek für die massenspektrale Fragmentierung, um die Massenspektren abzugleichen, um die in der Analyse identifizierten Metaboliten zu kommentieren. Die genauen Massen der MS1- und Isotopenmuster können ebenfalls identifiziert werden, um eine Annotation der Metaboliten mithilfe von Online-Datenbanken zu ermöglichen. Verwenden Sie dann die Bibliothek der Datenbanken und Spektren, um nach den MS2-Spektren der Rohdaten zu suchen.
Am nächsten Tag, nach dem Abschrecken der Hefezellen, waschen Sie die Zellen gründlich mit 15 Milliliter ABC-Puffer und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem ABC-Puffer und geben Sie 500 Mikroliter der Propidiumiodidlösung zu den Zellen. Wirbeln Sie die Probe dreimal für 10 Sekunden pro Wirbel durch und inkubieren Sie die Zellen für 10 Minuten auf Licht geschütztem Eis.
Am Ende der Inkubation sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen die Zellen dreimal mit einem Milliliter frischem ABC-Puffer pro Waschgang. Nach der letzten Wäsche das Pellet in 300 Mikrolitern frischem ABC-Puffer wieder aufschnen und 10 Mikroliter der resultierenden Zellsuspension zu einem Objektträger geben. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um differentielle Interferenzkontrast- und Fluoreszenzmikroskopiebilder der Zellen mit den Filtern auf eine Anregungswellenlänge von 593 Nanometer und eine Emissionswellenlänge von 636 Nanometer einzustellen.
Verwenden Sie dann ein geeignetes Bildanalyseprogramm, um die Gesamtzahl der Zellen in den Hellfeld- und Fluoreszenzbildern zu zählen und die Fluoreszenzintensität der Färbung für einzelne Zellen zu bestimmen. Das modifizierte Zellabschreckverfahren verursacht deutlich geringere Schäden an Plasmamembran und Zellwand als das nicht gepufferte 80%ige Methanol bei minus 40 Grad Celsius Abschreckmethode. Tatsächlich weisen fast alle Zellen, die mit der modifizierten Methode abgeschreckt werden, eine rote Fluoreszenzemission auf, die für Hefezellen charakteristisch ist, bei denen die Plasmamembran und die Zellwand nicht beschädigt sind.
Im Gegensatz dazu zeigten fast alle Zellen, die mit dem nicht gepufferten 80% Methanol bei 40 Grad Celsius-Methode abgeschreckt wurden, eine grüne Fluoreszenzemission, die für Hefezellen charakteristisch ist, bei denen die Plasmamembran und die Zellwand signifikant geschädigt sind. Die modifizierte Zellabschreckmethode bewirkt auch eine deutlich geringere Leckage von wasserlöslichen Metaboliten aus Hefezellen als die nicht gepufferte 80%ige Methanolmethode bei minus 40 Grad Celsius Abschreckmethode. Die Retentionszeitverschiebungswerte der wasserlöslichen Metabolitenstandards sind signifikant niedriger und die Peakformen sind für die zwitterionische Phasensäule wesentlich schärfer als für die Umkehrphasensäule.
Ein weiterer Vorteil der Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Methode ist die Fähigkeit, die zwitterionische Phasensäule zu verwenden, um verschiedene wasserlösliche Metaboliten mit verschiedenen strukturellen, physikalischen und chemischen Eigenschaften effizient zu trennen. Stellen Sie sicher, dass Sie das Propidiiumiodid im Dunkeln stehen und stellen Sie sicher, dass Sie die obere Phase sammeln, ohne die mittlere Phase zu stören. Wenn ein MSP aufgrund des Fehlens der MS2-Spektralbibliothek nicht mit Anmerkungen versehen werden kann, verwenden Sie eine NMR, um diese Struktur zu veranschaulichen.
