このプロトコルは、高い特異性、高感度を有し、また異性体、同種、親水性、疎水性分子を含む代謝産物の多くの異なるクラスをプロファイルすることができるので、現在使用されている酵母メタボロミクスよりも多くの利点を有する。このプロトコルで使用されるクエンチ法は、細胞からの代謝産物の漏出を著しく減少させながら、すべての酵素反応を停止します。このプロトコルで構築された MS1 ライブラリは、さまざまな MS2 実行から実行されます。
摂氏30度および1分間に200回転で一晩培養した後、1ミリリットルの培養で酵母細胞の数を決定し、フラスコ当たり45ミリリットルのオートクレーブYP培地を含む2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに5ミリリットルの殺菌された20%ストック溶液のグルコースを加える。滅菌転移ピペットを使用して、各フラスコに7番目の酵母細胞に10倍を加え、1分間に200回転で摂氏30度で少なくとも24時間酵母細胞を成長させます。代謝産物抽出の場合、培養後、遠心分離により酵母細胞を採取し、上清を素早く除去する。
チューブをドライアイスに置き、マイナス20度のクロロホルム2ミリリットル、マイナス20度メタノールの1ミリリットル、氷冷ナノ純水1ミリリットル、425〜600ミクロンの酸洗浄ガラスビーズ200マイクロリットルを細胞に加えます。ビーズを添加したら、アルミ箔で覆われたチューブをリテーナー付きのフォームチューブホルダーキットに入れ、サンプルを4°Cで中速で30分間渦を出して代謝物の抽出を容易にします。次に、サンプルを遠心分離する前にチューブを氷上で15分間インキュベートし、上部水相を中デブリおよびタンパク質および低有機相から分離できるようにします。
マイクロピペットを使用して、上水相の約400マイクロリットルを洗浄し、マイナス20°Cのアセトニトリルの800マイクロリットルを含む1.5ミリリットルチューブにラベル付けします。次いで、サンプルを遠心分離し、上清の上部の800マイクロリットルを、液体クロマトグラフィータンデム質量分析までゼロ度保存用の標識質量分析バイアルに移します。抽出した代謝物を分離するには、サンプルバイアルを15分間超音波処理し、続いて室温で3つの10秒渦を超音波処理します。
ボルテックスの後、バイアルを液体クロマトグラファーのウェルプレートに入れ、1分あたり0.25ミリリットルの流量でカラムを摂氏45度に、ウェルプレートを摂氏ゼロ度に設定します。次に、この表を使用して、分析用の液体クロマトグラフィー勾配を設定します。分離後、水溶性代謝物を同定し定量するために、加熱されたエレクトロスプレーイオン化を備えた質量分析計で、エレクトロスプレーイオン化正および負の両方のモードで10マイクロリットルのサンプルの注入を使用します。
解析の最後に、適切な化合物分析ソフトウェアプログラムで生データを開き、質量スペクトルを一致させるために質量スペクトルを利用して、分析で特定された代謝産物にアポイントを付けます。MS1 と同位体パターンの正確な質量を識別して、オンライン データベースを使用して代謝物の注釈を可能にすることもできます。次に、データベースとスペクトルのライブラリを使用して、生データの MS2 スペクトルを検索します。
翌日、酵母細胞を焼入れた後、15ミリリットルのABCバッファーで細胞を十分に洗浄し、遠心分離によって細胞を採取する。新鮮なABCバッファーの1ミリリットルにペレットを再懸濁し、500マイクロリットルのヨウ化プロピジウム溶液を細胞に加える。1渦あたり10秒間、サンプルを3回渦を起こして、光から保護された氷の上で細胞を10分間インキュベートする。
インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を採取し、1回の洗浄につき1ミリリットルの新鮮なABCバッファーで細胞を3回洗浄します。最後の洗浄後、新鮮なABCバッファーの300マイクロリットルにペレットを再懸濁し、得られた細胞懸濁液の10マイクロリットルを顕微鏡スライドに加えます。蛍光顕微鏡を使用して、593ナノメートルの励起波長と636ナノメートルの発光波長に設定されたフィルターを使用して、細胞の差動干渉コントラストと蛍光顕微鏡画像をキャプチャします。
次に、適切な画像解析プログラムを使用して、明視野画像および蛍光画像における細胞の総細胞数をカウントし、個々の細胞の染色の蛍光強度を決定します。改変細胞焼入法は、マイナス40°Cの焼入れ法で非緩衝化80%メタノールよりも、細胞膜および細胞壁への損傷を著しく低くする。実際、改変法を用いて焼入れを行った細胞のほとんどすべてが、赤い蛍光発光を示し、これは、細胞膜および細胞壁が損傷していない酵母細胞の特徴である。
これに対し、40°C法で非緩衝化80%メタノールを用いて焼入を行った細胞のほとんどすべてが、緑色の蛍光発光を示し、これは、細胞膜および細胞壁が著しく損傷している酵母細胞の特徴である。改変細胞焼入法はまた、マイナス40°Cの除菌法で非緩衝化80%メタノールよりも酵母細胞からの水溶性代謝物の漏出を著しく低くする。水溶性代謝産物標準の保持時間シフト値は有意に低く、ピーク形状は逆相カラムと比較してジウテリオニック相カラムに対して実質的に鋭い。
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法のもう1つの利点は、ジウィッテリオニック相カラムを使用して、多様な構造、物理的、化学的特性を持つ異なる水溶性代謝産物を効率的に分離できることです。暗闇の中に立ってヨウ化プロピジウムを行うことを確認し、また、中間相を乱さない間、上の段階を収集することを確認してください。MS2 スペクトル ライブラリがないためにどの MSP にも注意を付けることができない場合は、NMR を使用してこの構造を説明します。
