Un sistema di purificazione delle proteine ad alta produttività economico e versatile che utilizza un adattatore a piastre multi colonna. Ciao, la purificazione proteica è imperativa per lo studio della struttura e della funzione proteica. E di solito viene usato in combinazione con tecniche biofisiche.
Questo è particolarmente importante nell'era della proteomica funzionale che richiede una produzione proteica ad alto contenuto di produttività. Abbiamo ipotizzato che un adattatore a piastre multi-colonna, l'MCPA, possa interfacciare più colonne cromatografiche di diverse resine con piastre multi-pozzo per la purificazione parallela. Con questo adattatore, abbiamo sviluppato un metodo economico e versatile di purificazione proteica che può essere utilizzato sotto gravità o rivale sottovuoto nella velocità di un sistema automatizzato.
Qui mostriamo questo metodo per la cromatografia di affinità al nichel e la cromatografia a scambio ionico. Assemblare l'MCPA posizionando un tappetino di tenuta perforato su una lunga piastra a goccia, quindi inserire il numero desiderato di colonne nei fori del tappetino di tenuta. Posizionare un piastre di raccolta aperto nella base del collettore e chiudere con la parte superiore del collettore.
Attaccare i tubi e posizionare l'MCPA assemblato con colonne sulla parte superiore. Pipetta 1,2 mil della soluzione nichel-NTA nelle colonne. Durante la pipettazione, assicurarsi che le perline rimangano completamente miste.
Accendere la pompa ed eseguire il 20% di etanolo attraverso le colonne e nella piastra di raccolta sottostante. Spegnere la pompa una volta che il liquido è stato eseguito. Smaltire il contenuto della piastra di raccolta in una scatola di rifiuti.
Aggiungere tre volumi di resina di tampone EDTA a tutte le colonne. Accendere la pompa ed eseguire il liquido attraverso. Ora lavare le colonne con tre volumi di resina di 0,5 tampone molare di idrossido di sodio.
Lavare le colonne con quattro volumi di resina da 100 millimolare di solfato di nichel, quindi 10 volumi di resina di acqua Mili-Q. Se una colonna funziona più lentamente, spingere il liquido attraverso con lo stantuffo della siringa. Versare il contenuto delle piastre di raccolta in una scatola di rifiuti.
Quindi lavare le colonne due volte con quattro volumi di resina di tampone di lavaggio imidazolo millimolare e svuotare le piastre di raccolta. Se più campioni vengono purificati, sostituire le piastre di raccolta aperte con piastre da 48 potte. Con il vuoto spento, caricare i lire nelle colonne.
Utilizzare un sottile agitatore di plastica per mescolare delicatamente le perline e i liscivia nella colonna per massimizzare il legame. Accendere la pompa ed eseguire il liquido attraverso. Se una colonna viene bloccata, trasferire la miscela di resina lisato in una colonna con un filtro fresco.
Congelare le piastre di raccolta per contenere il flusso. Sostituito con una piastra di raccolta aperta e quindi lavare le colonne con nove volumi di resina di tampone di lavaggio imidazolo da 10 millimolare. Ripetere questo passaggio quattro o cinque volte.
Per evitare lo straripamento, svuotare periodicamente le lastre di rifiuti. Sostituire le piastre di raccolta aperte con una piastra da 96 po' di pozzo, assicurandosi che A1 si trova nell'angolo in alto a sinistra. Pipet un volume di resina del tampone di eluizione denaturante nelle colonne.
Far passare il liquido e controllare la piastra di raccolta per assicurarsi che non vi sia contaminazione tra i pozzi. Per la successiva diluizione, ripetere i passaggi precedenti e raccogliere in una piastra di raccolta fresca. Prendere un'aliquota di 50 microliter di ogni eluizione per l'analisi della purezza e della concentrazione.
Quindi, lavare le colonne con due millilitri di 20% di etanolo. Aggiungere altri due mil di 20% di etanolo alle colonne e utilizzare l'agitatore di plastica sottile fresco per mescolare le perline nell'etanolo prima di trasferirlo in un tubo da 50 mil per lo stoccaggio a quattro gradi Celsius. Assemblare l'MCPA in collettore sottovuoto con una piastra di raccolta aperta e pistoni per siringhe in tutte le colonne.
Rimuovere tutti i pistoni della siringa dalla prima fila. Rimuovere la guarnizione di gomma da uno stantuffo per siringhe da cinque mil e quindi perforare un foro al centro. Quindi spingere il fondo di una colonna aperta attraverso la guarnizione in gomma perforata.
Ripetere questi passaggi e inserirli nella prima riga delle colonne. Assicurarsi che le perle di sefarose Q siano completamente miste. E con la punta della pipetta blu che viene tagliata a due centimetri dal basso, pipettare 800 microlitri delle perline di sefarose Q nelle colonne aperte.
Una volta che le perline si sono depositate nella parte inferiore delle colonne, accendere la pompa del vuoto abbastanza da far passare il 20% di etanolo. Lavare le colonne due volte con due mil di Tris da 10 millimolare. Spegnere la pompa poco prima che il tampone Tris sia passato per evitare che la resina si asciughi.
Il deflusso può essere scartato e sostituito con piastre di raccolta da 48 potte. Trasferire tutti i campioni da purificare alle colonne Q Sepharose in prima fila e utilizzare un sottile agitatore di plastica per mescolare i campioni e le perline per circa due minuti prima di accendere la pompa per vuoto. Archiviare o bloccare il flusso per un'analisi successiva.
Con una piastra di raccolta aperta, lavare le colonne due volte con due mil di Tris da 10 millimolare. Sostituire le piastre di raccolta aperte con la piastra da 96 pozzi. La prima frazione di eluizione può essere raccolta in prima fila o in seconda riga.
Per elutare in seconda fila, rimuovere i pistoni della siringa da queste posizioni. Spostare le colonne Q Sepharose in queste posizioni e quindi posizionare i pistoni delle siringhe nelle colonne aperte nella prima riga. Pipettare un millilitro delle prime concentrazioni di sale nelle colonne di sefarose Q.
Accendere la pompa e raccogliere l'eluizione. Per raccogliere l'eluizione successiva, rimuovere i pistoni della siringa dalle posizioni seguenti, spostare le colonne Q Sepharose in queste posizioni e quindi sostituire i pistoni nelle posizioni precedenti. Ripetere questi passaggi per ogni successiva concentrazione di sale utilizzata per elute.
Assicurarsi che una nuova piastra di raccolta sia utilizzata per ogni quattro eluizioni e che ogni lastra sia etichettata e conservata. Con piastre di raccolta aperte, lavare le colonne con due milioni di quattro cloruro di sodio molare, tris da 10 millimolare. Pipet due mil di 20%etanolo ed eseguire questo attraverso fino a quando non è appena sopra le perline e quindi sigillare le colonne per la conservazione.
Ad esempio, l'MCPA ha purificato con successo 14 mutanti AbpSH3 in condizioni di denaturazione da una nichel-NTA. Un piccolo contaminante può essere visto a 25 kilodalton, anche se la proteina è ancora in gran parte pura. I piccoli contaminanti osservati in condizioni di denaturazione vengono rimossi in condizioni native.
Questo è stato mostrato quando 11 diversi domini SH3 sono stati purificati. Ciò dimostra che l'MCPA può essere utilizzato per il confronto delle condizioni di purificazione. AbpSH3 può essere separato dalla maggior parte dei contaminanti attraverso la purificazione dello scambio ionici dai lisati.
Buone rese di proteine AbpSH3 notevolmente pure sono state recuperate con vari contaminanti a peso molecolare più elevato. La purificazione dei campioni dopo nichel-NTA mediante scambio ionici con l'MCPA ha rimosso con successo questi contaminanti ad alto peso. Sebbene vi sia ancora una leggera contaminazione, le frazioni sono ancora in gran parte pure e hanno prodotto buoni dati biofisici utilizzando NMR e test di denaturazione chimica termica.
In conclusione, i nostri risultati mostrano che la nostra ipotesi è corretta e che l'MCPA può purificare con successo quantità di milligrammo di proteine utilizzando diverse tecniche di cromatografia. Il sistema MCPA può essere configurato in più modi all'interno delle stesse esecuzioni per ottimizzare le condizioni di purificazione. La configurazione è semplice, economica e facile da addestrare utenti inesperti, specialmente nei laboratori che non purificano regolarmente le proteine.
