Экономичная и универсальная высокопроизводительная система очистки белка с использованием многоколоночного пластинчатого адаптера. Привет, очистка белка необходима для изучения структуры и функции белка. И он обычно используется в сочетании с биофизическими методами.
Это особенно важно в эпоху функциональной протеомики, требующей высокопроизводительной выработки белка. Мы предположили, что многоколонный пластинчатый адаптер MCPA может сопровождать несколько хроматографических колонок различных смол с многостворчатыми пластинами для параллельной очистки. С помощью этого адаптера мы разработали экономичный и универсальный метод очистки белка, который можно использовать под действием силы тяжести или вакуума конкурента по скорости автоматизированной системы.
Здесь мы показываем этот метод для никелевой аффинной хроматографии и ионообмонной хроматографии. Соберите MCPA, поместив проколотый уплотнительный мат на длинную капельную пластину, затем вставьте нужное количество колонн в отверстия уплотнительного мата. Поместите открытые пластины сбора в основание коллектора и закройте его верхней частью коллектора.
Прикрепите трубку и поместите собранный MCPA с колоннами сверху. Пипетка 1,2 мил раствора никель-НТА в колонны. Во время пипетки убедитесь, что бусины остаются полностью смешанными.
Включите насос и запустите 20% этанол через колонны и в коллекционную пластину ниже. Выключите насос, как только жидкость пройдет. Утилизируйте содержимое коллекционной пластины в ящик для мусора.
Добавьте три тома смолы буфера EDTA во все столбцы. Включите насос и прогоните жидкость. Теперь промыть колонны тремя смоляными объемами 0,5 молярного буфера гидроксида натрия.
Промыть колонны четырьмя объемами смолы 100 миллимолярного сульфата никеля, затем 10 смоляными объемами воды Mili-Q. Если колонна работает медленнее, протолкните жидкость с помощью шприцевого плунжера. Вылейте содержимое коллекционных тарелок в мусорный ящик.
Затем дважды промыть колонны четырьмя объемами смолы 10 миллимоляров имидазола промыть буфер и опорожнить пластины сбора. Если очищается несколько образцов, замените открытые сборные пластины на 48-скважинные пластины. После выключения вакуума загрузите лизаты в колонны.
Используйте тонкую пластиковую мешалку, чтобы аккуратно смешать бусины и лизаты в колонке, чтобы максимизировать связывание. Включите насос и прогоните жидкость. Если столб блокируется, перенесите смесь из лизатной смолы в столбец со свежим фильтром.
Заморозьте пластины для сбора, чтобы они содержали сквозной поток. Заменена открытая сборная пластина, а затем промываем колонны девятью смоляными объемами 10 миллимолярного имидазола промывочного буфера. Повторите этот шаг четыре или пять раз.
Чтобы избежать переполнения, периодически опорожняйте мусорные плиты. Замените открытые пластины сбора на пластину с 96 скважинами, убедив, что A1 находится в верхнем левом углу. Пипетка одного смоляного объема денатурирования элюирующего буфера в колонны.
Прогоните жидкость и проверьте коллекторную пластину, чтобы убедиться, что между скважинами нет загрязнения. Для следующего разведения повторите предыдущие шаги и соберите в свежую коллекционную тарелку. Возьмите 50 микролитровую аликвоту каждого элюирования для анализа чистоты и концентрации.
Далее промыть колонны двумя миллилитрами 20% этанола. Добавьте еще два мил 20% этанола в колонки и используйте свежую тонкую пластиковую мешалку, чтобы смешать шарики в этаноле перед переносом в 50-мильную трубку для хранения при четырех градусах Цельсия. Соберите MCPA в вакуумном коллекторе с открытой коллекторной пластиной и шприцевыми плунжерами во всех колоннах.
Снимите все шприцевые плунжеры с первого ряда. Снимите резиновую прокладку с поршеня шприца на пять миль, а затем проткните отверстие в центре. Затем протолкнуть дно открытой колонны через проколотую резиновую прокладку.
Повторите эти шаги и вставьте в первый ряд столбцов. Убедитесь, что бусины Q sepharose полностью перемешаны. А с помощью синего наконечника пипетки, который вырезан на два сантиметра от дна, пипеткой 800 микролитров бусины Сефарозы Q в открытые колонны.
После того, как шарики осядят на дно колонн, включите вакуумный насос настолько, чтобы провести 20% этанол. Дважды промыть колонны двумя мил по 10 миллимоляров Трис. Выключите насос непосредственно перед прохождением буфера Tris, чтобы предотвратить высыхание смолы.
Стоки могут быть выброшены и заменены 48-скважинными коллекторными пластинами. Перенесите все образцы для очистки в колонны Q Sepharose в первом ряду и используйте тонкую пластиковую мешалку для смешивания образцов и шариков в течение примерно двух минут, прежде чем включить вакуумный насос. Сохраните или заморозьте сквозной поток для последующего анализа.
С открытой коллекционной пластиной дважды промыть колонны двумя мил по 10 миллимоляров Трис. Замените открытые пластины сбора на пластину с 96 скважинами. Первая фракция элюирования может быть собрана в первом ряду или во втором ряду.
Чтобы элюировать во втором ряду, снимите шприцевые плунжеры с этих позиций. Переместите столбцы Q Sepharose в эти позиции, а затем поместите шприцевые плунжеры в открытые столбцы в первом ряду. Пипет один миллилитр первых концентраций соли в колонны Q Sepharose.
Включите насос и соберите элюирование. Чтобы собрать следующее элюирование, снимите шприцевые плунжеры со следующих позиций, переместите столбцы Q Sepharose в эти позиции, а затем замените плунжеры в предыдущих положениях. Повторите эти шаги для каждой последующей концентрации соли, используемой для элюирования.
Убедитесь, что новая пластина для сбора используется для каждых четырех элюионов и что каждая пластина помечена и хранится. С открытыми пластинами сбора промыть колонны двумя милами из четырех моляров хлорида натрия, 10 миллимоляров Трис. Пипетите два мил 20% этанола и проведите его до тех пор, пока он не окажется чуть выше бусин, а затем запечатайте колонны для хранения.
Например, MCPA успешно очистил 14 мутантов AbpSH3 в условиях денатурирования никелем-NTA. Небольшое загрязняемое вещество можно увидеть при 25 килодальтонах, хотя белок все еще в значительной степени чистый. Мелкие загрязняющие вещества, наблюдаемые в условиях денатурирования, удаляются в нативных условиях.
Это было показано, когда 11 различных доменов SH3 были очищены. Это показывает, что MCPA можно использовать для сравнения условий очистки. AbpSH3 может быть отделен от большинства загрязняющих веществ путем ионообмонной очистки от лизатов.
Хорошие выходы значительно чистого белка AbpSH3 были восстановлены с различными загрязняющими веществами с более высокой молекулярной массой. Очистка образцов после никеля-NTA с использованием ионного обмена с MCPA успешно удалила эти высокомагистровые загрязняющие вещества. Хотя все еще существует небольшое загрязнение, фракции по-прежнему в значительной степени чисты и дают хорошие биофизические данные с использованием ЯМР и термических химических анализов денатурации.
В заключение, наши результаты показывают, что наша гипотеза верна и что MCPA может успешно очищать миллиграммовые количества белков, используя различные методы хроматографии. Система MCPA может быть сконфигурирована несколькими способами в рамках одних и тех же прогонов для оптимизации условий очистки. Установка проста, дешева и легко обучается неопытным пользователям, особенно в лабораториях, которые обычно не очищают белки.
