Os estágios de organogênese nos embriões do camundongo permanecem parcialmente mal estudados devido à difícil visualização das estruturas complexas do embrião. Este protocolo descreve técnicas que permitem visualização e análise 3D e 4D de embriões de camundongos durante a extensão e segmentação axiais. A principal vantagem dessa técnica é que permite aos pesquisadores estudar e mostrar as estruturas complexas do embrião do camundongo como objetos dinâmicos 3D.
Este protocolo contém técnicas que podem ser utilizadas no estudo de malformações congênitas que afetam a vértebra e a medula espinhal dos mamíferos, como a escoliose. Essas técnicas também podem ser utilizadas com sistemas de modelos in vitro, permitindo assim o estudo do desenvolvimento embrionário humano. Para preparar embriões de camundongos entre o dia embrionário 8.25 e o dia embrionário 10.5 para imagens vivas, disseque os embriões em meio M2 pré-aquecido a 37 graus Celsius.
Remova suavemente o saco de gema usando fórceps limpos e lave o embrião uma vez com meio M2 fresco para remover sangue e detritos produzidos durante a dissecção. Durante o procedimento de imagem ao vivo, incubar embriões em mamomicas de baixa glicose suplementadas com FBS 10% de hipclone definida, dois milimolar L-glutamina e estreptomicina de 1%penicilina em uma câmara aquecida de 37 graus Celsius e um oxigênio de 65% com 5% de gás. Para preparar embriões de camundongos de estágio semelhante para microscopia de imunofluorescência, em vez de usar M2 aquecido, disseque os embriões em PBS frio e fixe em 4%de paraformaldeído.
Depois de executar todo o protocolo de coloração de imunofluorescência do montagem, conforme descrito no manuscrito do texto, a liberação de tecido pode ser alcançada usando o RapiClear. Primeiro, coloque os embriões no centro de um slide de vidro côncavo de depressão de 75 por 25 milímetros, remova todo o PBST no slide de depressão do microscópio e adicione 200 microlitros de solução de compensação, em seguida, cubra a preparação do slide com uma caixa. Após 10 minutos protegidos da luz, quando os embriões começarem a se tornar transparentes, substitua a solução de compensação e espere mais 20 minutos.
Cubra o embrião com uma mancha de cobertura começando de um lado e movendo-se suavemente em direção ao outro. A amostra está pronta para a imagem. Para limpar o uso de saliciilato de metila ou BABB, certifique-se de que os embriões estejam completamente desidratados em 100% de metanol e, em seguida, inicie a série de BABB e metanol com aumentos sucessivos de 20% na concentração e uma incubação de 20 minutos para cada etapa.
Quando a solução BABB atingir 100% faça duas mudanças adicionais para uma nova solução. Prepare uma lâmina de vidro de cobertura de 20 por 60 milímetros 1,5 para montar os embriões para evitar comprimir a amostra. Adicione espaçadores feitos de lavadoras de metal fina.
Transfira os embriões limpos para os slides do microscópio usando um palito, uma ponta de algodão fino ou uma pipeta Pasteur. Em seguida, adicione uma gota de meio de montagem, cubra com outro vidro de cobertura semelhante e vedação com parafina derretida para estabilizar melhor a preparação para evitar bolhas. Coloque a mancha de cobertura de um lado e, em seguida, deslize-a gradualmente e suavemente para os lados, adicionando mais meio, se necessário.
A amostra está pronta para ser imagem no microscópio. Use Fiji/ImageJ para reposicionar o embrião em uma posição padronizada do eixo anterior-posterior e dorsal-ventral após a imagem. Reduza o tamanho do conjunto de dados na imagem de Fiji e, em seguida, dimensione e insira os valores da escala X, Y e Z necessários para reduzir o conjunto de dados para menos de 200 megabytes.
Certifique-se de que a nova opção de janela de criação esteja marcada. Em seguida, vá para plugins e abra o Visualizador 3D. Dentro da janela 3D Viewer, clique sobre o embrião para selecioná-lo, fazendo com que uma caixa 3D vermelha apareça.
Ao usar este modo, controle a rotação do conjunto de dados com um mouse. Depois de garantir a posição perfeita do embrião, selecione editar, transformar a imagem e exportar imagem transformada na janela 3D Viewer. Inspecione os diferentes planos ortogonais e vá para a imagem, empilhe e selecione vistas ortogonais.
Quando o embrião estiver corretamente posicionado, selecione o menu de janela 3D Viewer e, em seguida, edite, transforme e salve a matriz de transformação em um arquivo de texto com uma extensão de tapete. Abra o arquivo de texto usando Fiji/ImageJ, remova as duas primeiras linhas e re-salve. Isso cria um arquivo de matriz de transformação compatível com o plugin TransformJ.
Mude para o conjunto de dados de resolução completa e execute os plugins de operação TransformJ e TransformJ affine. Na nova janela, navegue para procurar o arquivo de matriz previamente salvo, selecione a interpolação cúbica de spline B e resample isotropicamente e clique em OK. Depois de reposicionar adequadamente o embrião, corte a maior parte do espaço vazio criado. Para executar uma imagem completa de projeção Z, clique em stacks, Projeto Z e escolha a intensidade máxima.
Em seguida, desenhe o ROI mínimo que contém todo o embrião em X e Y.Switch para as janelas de imagem original do conjunto de dados clicando em editar, selecionar, restaurar a seleção e cortar selecionando imagem. Corte as fatias no início e no final que não cruzem tecidos de embrião selecionando pilhas de imagem e abertura, clique em ferramentas, selecione o removedor de fatias e especifique a primeira e última fatia a ser removida, certificando-se de alterar o incremento para uma. Se desejar, realize uma análise mais aprofundada e reconstruções 3D usando as instruções no manuscrito do texto.
Para realizar a análise 3D de embriões mais desenvolvidos, dissecar fetos embrionários no pbs frio, remover todas as membranas embrionárias extras e depois lavar os fetos várias vezes em PBS fresco para remover sangue e detritos produzidos durante o procedimento de dissecção. Fixar fetos em 4%PFA feito em PBS a quatro graus Celsius por cinco a sete dias. Depois de lavar o embrião várias vezes na PBS, desidrate os fetos incubando em 10%10 aumentos sucessivos de soluções de metanol até que 100% de metanol seja alcançado.
Realize cada incubação por 25 minutos em um shaker à temperatura ambiente. Em seguida, incubar fetos separadamente em um shaker primeiro por um dia em peróxido de hidrogênio de 5% em metanol e, em seguida, em peróxido de hidrogênio de 10% em metanol por até três dias até que os embriões percam toda a pigmentação natural. Reidratar gradualmente os embriões em uma série de metanol reverso em água desmineralizada a cada incubação por 20 minutos em um agitador à temperatura ambiente, em seguida, lave os embriões três vezes por 30 minutos por lavagem em água desmineralizada.
Para incorporar fetos em blocos de 1%agarose, encha um tubo plástico de 50 mililitros ou seringa com agarose derretida, em seguida, coloque o feto na ágarose em uma posição vertical e mantenha esta posição com fórceps durante a solidificação da agarose. Coloque o molde com o bloco a quatro graus Celsius por 30 minutos para que a agarose para gelatina completa, em seguida, remova o bloco de agarose com o feto do molde e coloque-o em um recipiente com água desmoralizada. Realize a desidratação do feto gradualmente com aumentos de 10% na concentração de metanol diluída em água desmineralizada ou PBS, mantendo a amostra na concentração de metanol por pelo menos 45 minutos em temperatura ambiente em um shaker até que 100% de metanol seja atingido.
Limpe os fetos movendo-os através de uma solução babb série e metanol por 2,5 horas em cada concentração com aumentos de 25% na concentração de BABB até atingir 100% BABB. Substitua a solução BABB por uma nova todos os dias até que o feto esteja completamente transparente. Esse processo pode levar de três a cinco dias.
Use cola para anexar o bloco de agarose desmatada ao eixo motor do scanner OPT, em seguida, ajuste a óptica para obter uma imagem de todo o feto e prossiga para adquirir um conjunto de dados de projeção completa. A técnica de imagem ao vivo 4D permite a análise dinâmica da expressão do repórter LuVeLu e embriões embriões de nocaute embrionários 8,5 Snai1-conditional. Juntamente com o sinal normal de LuVeLu no mesoderme presomótico, embriões de nocaute condicionais Snai1 exibem expressão LuVeLu na protuberância ectópica que surge da raia primitiva.
Ensaios de imunofluorescência de montagem inteira permitem a detecção de potenciais NMPs e reguladores-chave da diferenciação do mesoderm. Setas brancas e amarelas destacam diferenças nos embriões mutantes e selvagens. A renderização 3D de imunostainings de montagem inteira permitem uma melhor compreensão do tecido ou estrutura no estudo.
Neste caso, foi investigada a localização de potenciais NMPs no broto da cauda. Reconstruções de tecidos 3D também são importantes para entender e caracterizar defeitos morfológicos em embriões de camundongos. A visualização interativa da reconstrução 3D também pode ser construída em formatos fáceis de usar.
Por exemplo, em um arquivo PDF. Essas estruturas caudais de embrião 3D podem ser usadas para ilustrar o poder dos modelos 3D para um público mais geral e para ajudar no estudo no ensino de um alongamento axial de vertebrados e segmentação. Finalmente, a visualização 3D em toto de embriões de camundongos mais desenvolvidos é possível usando a técnica de microscopia OTP.
Renderizações animadas são mostradas aqui, destacando as principais fatias dos fetos embrionários do dia 18,5. O mais importante a se lembrar é que o resultado deve permanecer uma representação fiel do que é observado no embrião. Os pesquisadores podem usar esses métodos para ir além de apresentar apenas estática às imagens, mas também incluir vídeos, reconstruções tridimensionais e até modelos 3D interativos de seus dados.
