마우스 배아의 유기 생성 단계는 배아 복합체 구조의 어려운 시각화로 인해 부분적으로 제대로 연구되지 않은 채로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 축 방향 확장 및 세분화 중에 마우스 배아의 3D 및 4D 시각화 및 분석을 허용하는 기술을 설명합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 연구자가 마우스 배아의 복잡한 구조를 3D 동적 개체로 연구하고 보여줄 수 있다는 것입니다.
이 프로토콜은 척추측만증과 같은 포유동물의 척추 및 척수에 영향을 미치는 선천성 기형의 연구에 사용될 수 있는 기술을 포함하고 있다. 이들 기술은 또한 시험관내 모델 시스템과 함께 사용될 수 있으며, 따라서 인간 배아 발달에 대한 연구를 허용한다. 생생 영상화를 위해 배아 8.25일째와 배아 10.5일 사이에 마우스 배아를 준비하려면, 섭씨 37도에서 미리 예열된 M2 배지에서 배아를 해부한다.
깨끗한 포셉을 사용하여 노른자 낭을 부드럽게 제거하고 신선한 M2 배지로 배아를 한 번 씻어 해부 중에 생성 된 혈액과 이물질을 제거하십시오. 라이브 이미징 절차 동안, 배아를 섭씨 37도 가열된 챔버 및 5%이산화탄소 환경을 갖는 65%산소에서 10%HyClone 정의 FBS, 2밀리몰 L-글루타민 및 1%페니실린 스트렙토마이신으로 보충된 저글루코스 DMEM 배지에서 배양한다. 면역 형광 현미경을 위해 유사한 단계의 마우스 배아를 제조하기 위해 가열 된 M2를 사용하는 대신 차가운 PBS에서 배아를 해부하고 4 % 파라 포름 알데히드에 고정하십시오.
텍스트 원고에 기재된 바와 같이 전체 마운트 면역형광 염색 프로토콜을 수행한 후, RapiClear를 사용하여 조직 클리어런스를 달성할 수 있다. 먼저, 배아를 75 x 25 밀리미터 함몰 오목 유리 슬라이드의 중앙에 놓고 현미경 우울증 슬라이드의 모든 PBST를 제거하고 200 마이크로 리터의 클리어링 용액을 첨가 한 다음 슬라이드 준비를 상자로 덮으십시오. 빛으로부터 10 분 보호 한 후, 배아가 투명해지기 시작하면 개간 용액을 교체하고 추가로 20 분을 기다리십시오.
한쪽에서 시작하여 다른 쪽으로 부드럽게 움직이는 커버 슬립으로 배아를 꼭대기에 올려 놓습니다. 이제 샘플을 이미징할 준비가 되었습니다. 메틸 살리실레이트 또는 BABB를 사용하여 클리어링을 위해, 배아가 100%메탄올에서 완전히 탈수되었는지 확인한 다음, 20% 연속 농도 증가로 일련의 BABB 및 메탄올을 시작하고 각 단계에 대해 20분간 인큐베이션한다.
BABB 솔루션이 100%에 도달하면 새로운 솔루션을 위해 두 가지 추가 변경을 수행합니다. 20 x 60 밀리미터 1.5 커버 글라스 슬라이드를 준비하여 배아를 장착하여 시료를 압축하지 않도록 한다. 얇은 금속 와셔로 만든 스페이서를 추가하십시오.
이쑤시개, 미세한 면화 팁 또는 파스퇴르 피펫을 사용하여 클리어 된 배아를 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 그런 다음 장착 매체 한 방울을 추가하고 다른 유사한 커버 유리로 덮고 녹은 파라핀으로 밀봉하여 거품을 피하기 위해 준비를보다 잘 안정화하십시오. 커버 슬립을 한쪽에 놓은 다음 점차적으로 옆으로 부드럽게 밀어 필요한 경우 더 많은 매체를 추가하십시오.
샘플은 이제 현미경으로 이미징 할 준비가되었습니다. 피지 / ImageJ를 사용하여 이미징 후 배아를 표준화 된 전후 및 등쪽 - 복부 축 위치로 재배치하십시오. 피지 이미지에서 데이터 세트 크기를 줄인 다음 데이터 세트를 200MB 미만으로 줄이는 데 필요한 X, Y 및 Z 배율 값을 확장하고 삽입합니다.
새 창 만들기 옵션이 선택되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 플러그인으로 이동하여 3D 뷰어를 엽니 다. 3D 뷰어 창 내에서 배아를 클릭하여 선택하면 빨간색 3D 상자가 나타납니다.
이 모드를 사용하는 경우 마우스로 데이터 세트의 회전을 제어합니다. 배아의 완벽한 위치를 확인한 후 편집을 선택하고 이미지를 변형하고 3D 뷰어 창에서 변환 된 이미지를 내보냅니다. 다른 직교 평면을 검사한 다음 이미지로 이동한 다음 직교 뷰를 스택하고 선택합니다.
배아가 올바르게 배치되면 3D 뷰어 창 메뉴를 선택한 다음 변형 행렬을 편집, 변형 및 매트 확장자를 가진 텍스트 파일에 저장합니다. 피지 / ImageJ를 사용하여 텍스트 파일을 열고 처음 두 줄을 제거한 다음 다시 저장하십시오. 이렇게 하면 TransformJ 플러그인과 호환되는 변환 행렬 파일이 생성됩니다.
전체 해상도 데이터 세트로 전환하고 작업 플러그인 TransformJ 및 TransformJ affine을 수행하십시오. 새 창에서 이전에 저장한 매트릭스 파일을 검색하고, 입방 B-스플라인 보간을 선택한 다음 등방성으로 다시 샘플링한 다음 확인을 클릭합니다. 배아의 위치를 적절하게 바꾼 후 생성 된 빈 공간의 대부분을 다듬습니다. 전체 Z 프로젝션 이미지를 수행하려면 스택, Z 프로젝트를 클릭하고 최대 강도를 선택합니다.
그런 다음 X와 Y.Switch의 전체 배아를 포함하는 최소 ROI를 이미지를 선택하여 편집, 선택, 선택 복원 및 자르기를 클릭하여 원래 데이터 세트 이미지 창으로 그립니다. 이미지를 선택하고 스택을 열어 배아 조직을 교차하지 않는 슬라이스를 트리밍하고, 도구를 클릭하고, 슬라이스 제거기를 선택하고, 제거 할 첫 번째 슬라이스와 마지막 슬라이스를 지정하여 증분을 하나로 변경하십시오. 원하는 경우 텍스트 원고의 지침을 사용하여 추가 분석 및 3D 재구성을 수행하십시오.
보다 발달된 배아의 3D 분석을 수행하기 위해, 차가운 PBS에서 배아 18.5일째 태아를 해부하고, 모든 여분의 배아막을 제거한 다음, 신선한 PBS에서 태아를 여러 번 세척하여 해부 과정 중에 생성된 혈액과 이물질을 제거한다. PBS로 만든 4 % PFA의 태아를 섭씨 4도에서 칠일 동안 고정하십시오. 배아를 PBS로 여러 번 세척한 후, 100%메탄올에 도달할 때까지 10%10 증가된 메탄올 용액에서 배양함으로써 태아를 탈수시킨다.
실온에서 진탕기 상에서 25분 동안 각각의 인큐베이션을 수행한다. 다음으로, 태아를 메탄올 중 5% 과산화수소에서 하루 동안 먼저 진탕기에서 따로 배양한 다음, 배아가 모든 천연 색소침착을 잃을 때까지 최대 3일 동안 메탄올 중의 10% 과산화수소에서 배양한다. 역메탄올 계열의 배아를 탈염수에 서서히 재수화시키고 실온에서 진탕기에서 20분 동안 각각 배양한 다음, 탈염수로 세척당 30분 동안 배아를 3회 세척한다.
태아를 1 % 아가로스 블록에 묻히려면 녹은 아가로스로 50 밀리리터 플라스틱 튜브 또는 주사기를 채운 다음 아가로스를 수직 위치에 태아를 놓고 아가로스를 응고시키는 동안 포셉으로이 위치를 유지하십시오. 블록이있는 곰팡이를 섭씨 4도에 30 분 동안 놓아 아가로스가 완전히 젤화되도록 한 다음 태아가있는 아가로스 블록을 곰팡이에서 꺼내 사기가 저하 된 물로 용기에 넣으십시오. 탈염수 또는 PBS에 희석된 메탄올 농도가 10% 증가하면서 태아 탈수를 점진적으로 수행하고, 100%메탄올에 도달할 때까지 진탕기에서 실온에서 45분 이상 동안 시료를 메탄올 농도로 유지한다.
100%BABB에 도달할 때까지 BABB 농도가 25% 증가하면서 각 농도에서 2.5시간 동안 일련의 BABB 용액과 메탄올을 통해 이들을 이동시켜 태아를 맑게 한다. BABB 용액을 태아가 완전히 투명해질 때까지 매일 신선한 용액으로 교체하십시오. 이 과정은 사흘에서 오일이 걸릴 수 있습니다.
접착제를 사용하여 클리어 된 아가로스 블록을 OPT 스캐너의 모터 축에 부착 한 다음 광학을 조정하여 전체 태아의 이미지를 얻고 전체 프로젝션 데이터 세트를 획득하십시오. 4D 라이브 이미징 기술은 LuVeLu 리포터 발현 및 배아 8.5일 Snai1 조건부 녹아웃 배아의 동적 분석을 가능하게 합니다. 전치산 중배엽의 정상적인 LuVeLu 신호와 함께, Snai1-conditional 녹아웃 배아는 원시적 줄무늬에서 발생하는 자궁외 팽창에서 LuVeLu 발현을 표시합니다.
전체 마운트 면역형광 분석은 잠재적인 NMPs 및 중배엽 분화의 주요 조절인자의 검출을 허용한다. 흰색과 노란색 화살표는 돌연변이 및 야생형 배아의 차이를 강조합니다. 전체 마운트 면역염색의 3D 렌더링은 연구에서 조직 또는 구조를 더 잘 이해할 수 있게 합니다.
이 경우, 꼬리 새싹에서 잠재적인 NMPs의 위치를 조사하였다. 3D 조직 재구성은 마우스 배아의 형태 학적 결함을 이해하고 특성화하는 데에도 중요합니다. 3D 재구성의 인터랙티브 시각화는 사용자 친화적 인 형식으로 구축 할 수도 있습니다.
예를 들어, PDF 파일에서. 이러한 3D 배아 꼬리 구조는보다 일반적인 청중에게 3D 모델의 힘을 설명하고 척추 동물 축 신장 및 세분화를 가르치는 연구에 도움이되는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, OTP 현미경 기술을 이용하여 더욱 발달된 마우스 배아의 3D 토토 시각화가 가능하다.
애니메이션 렌더링이 여기에 표시되어 배아 18.5 태아의 주요 조각을 강조 표시합니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 결과가 배아에서 관찰되는 것을 충실하게 표현해야한다는 것입니다. 연구원은 이러한 방법을 사용하여 이미지에 정적 인 것을 제시하는 것을 넘어 비디오, 3 차원 재구성 및 데이터의 대화 형 3D 모델도 포함 할 수 있습니다.
