שלבי האורגנוגנזה בעוברי העכבר עדיין נחקרים בצורה גרועה חלקית בשל ההדמיה הקשה של המבנים המורכבים העובריים. פרוטוקול זה מתאר טכניקות המאפשרות הדמיה וניתוח תלת-ממדיים ודו-ממדיים של עוברי עכבר במהלך הרחבה צירית וסגמנטציה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לחקור ולהראות את המבנים המורכבים של עובר העכבר כאובייקטים דינמיים תלת-ממדיים.
פרוטוקול זה מכיל טכניקות שניתן להשתמש בהן בחקר מומים מולדים המשפיעים על החוליה ועל חוט השדרה של יונקים, כגון עקמת. טכניקות אלה יכולות לשמש גם עם מערכות מודל הפריה חוץ גופית, ובכך לאפשר את המחקר של התפתחות עוברית אנושית. כדי להכין עוברי עכבר בין יום עוברי 8.25 ויום עוברי 10.5 להדמיה חיה, לנתח את העוברים במדיום M2 שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס.
הסר בעדינות את שק החלמון באמצעות מלקחיים נקיים ושטוף את העובר פעם אחת עם מדיום M2 טרי כדי להסיר דם ופסולת המיוצרים במהלך הניתוח. במהלך הליך ההדמיה החיה, עוברים דגירה במדיום DMEM גלוקוז נמוך בתוספת 10% HyClone מוגדר FBS, שני מילימולרי L-גלוטמין, ו 1%פניצילין סטרפטומיצין בתא מחומם 37 מעלות צלזיוס ו 65% חמצן עם 5% סביבת דו תחמוצת הפחמן. כדי להכין עוברי עכבר במה דומה עבור מיקרוסקופיה immunofluorescence, במקום להשתמש M2 מחומם, לנתח את העוברים PBS קר ולתקן ב 4% paraformaldehyde.
לאחר ביצוע כל פרוטוקול הכתמת אימונופלואורסצנטיות בהר כמתואר בכתב היד של הטקסט, ניתן להשיג אישור רקמות באמצעות RapiClear. ראשית, מניחים את העוברים במרכז של 75 על 25 מילימטר דיכאון קעור שקופית זכוכית, להסיר את כל PBST במגלשת דיכאון מיקרוסקופ ולהוסיף 200 מיקרוליטרים של פתרון ניקוי, ולאחר מכן לכסות את הכנת השקופית עם תיבה. לאחר 10 דקות מוגן מפני האור, כאשר עוברים מתחילים להיות שקופים, להחליף את פתרון הסליקה ולחכות 20 דקות נוספות.
מעל העובר עם כיסוי החל מצד אחד ונע בעדינות לכיוון השני. הדגימה מוכנה כעת להדמיה. עבור ניקוי באמצעות מתיל סליצילאט או BABB, להבטיח כי העוברים מיובשים לחלוטין ב 100% מתנול ולאחר מכן להתחיל את הסדרה של BABB ו מתנול עם 20% עליות רצופות בריכוז ודגרה של 20 דקות עבור כל צעד.
כאשר פתרון BABB מגיע ל- 100%, בצע שני שינויים נוספים עבור פתרון חדש. הכן שקופית זכוכית 20 על 60 מילימטר 1.5 לכסות כדי להרכיב את העוברים, כדי למנוע דחיסת המדגם. הוסיפו מרווחים העשויים ממכונות כביסה ממתכת דקה.
העבירו את העוברים המנוקים למגלשות המיקרוסקופ באמצעות קיסם, קצה כותנה דק או פיפטה פסטר. לאחר מכן מוסיפים טיפה של מדיום הרכבה, לכסות עם עוד כיסוי דומה ולאטום עם פרפין מומס כדי לייצב טוב יותר את ההכנה כדי למנוע בועות. מניחים את כיסוי על צד אחד ולאחר מכן בהדרגה ובעדינות להחליק אותו לצדדים, הוספת בינוני יותר במידת הצורך.
המדגם מוכן כעת לתמונה במיקרוסקופ. השתמש בפיג'י/ImageJ כדי למקם מחדש את העובר בתנוחת ציר קדמי-אחורי-אחורית מתוקננת לאחר הדמיה. הקטן את גודל ערכת הנתונים בתמונה של פיג'י ולאחר מכן שנה את קנה המידה והוסף את ערכי קנה המידה X, Y ו- Z הדרושים כדי להקטין את ערכת הנתונים לפחות מ- 200 מגה-בתים.
ודא שהאפשרות צור חלון חדש מסומנת. לאחר מכן עבור אל תוספים ופתח את מציג התלת-ממד. בתוך חלון מציג התלת-ממד, לחץ על העובר כדי לבחור אותו, מה שגרם להופעת תיבת תלת-ממד אדומה.
בעת שימוש במצב זה, שלוט בסיבוב ערכת הנתונים באמצעות עכבר. לאחר הבטחת המיקום המושלם של העובר, בחרו 'עריכה', 'שנה צורה של התמונה' ו'ייצוא תמונה שעברה שינוי צורה בחלון 'מציג התלת-ממד'. בדוק את המישורים האורתוגונליים השונים ולאחר מכן עבור לתמונה ולאחר מכן הערם ובחר תצוגות אורתוגונליות.
כשהעובר ממוקם כראוי, בחרו בתפריט החלון 'מציג התלת-ממד' ולאחר מכן ערכו, שינו ושמרו מטריצת המרה לקובץ טקסט עם סיומת מחצלת. פתח את קובץ הטקסט באמצעות Fiji/ImageJ, הסר את שתי השורות הראשונות ושמור מחדש. פעולה זו יוצרת קובץ מטריצת המרה התואם לתוסף TransformJ.
עברו לערכת הנתונים ברזולוציה מלאה ובצעו את תוספי הפעולה TransformJ ו-TransformJ affine. בחלון החדש, אתר כדי לחפש את קובץ המטריצה שנשמר בעבר, בחר את האינטרפולציה הקובית B-spline ודגום מחדש איזוטרופית ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר מיקום מחדש כראוי של העובר, חתוך את רוב השטח הריק שנוצר. כדי לבצע תמונת הקרנת Z מלאה, לחץ על ערימות, Z Project ובחר בעוצמה מרבית.
לאחר מכן צייר את ההחזר המינימלי המכיל את העובר כולו ב- X ו- Y.עבור לחלונות התמונה המקוריים של ערכת הנתונים על-ידי לחיצה על עריכה, בחירה, שחזור בחירה וחיתוך על-ידי בחירת תמונה. חותכים את הפרוסות בהתחלה ובסוף שאינן מצטלבות רקמות עובר על ידי בחירת תמונה ופתיחת ערימות, לחץ על כלים, בחר את מסיר הפרוסה וציין את הפרוסה הראשונה והאחרונה להסרה, תוך הקפדה על שינוי ההפרש הקבוע לאחת. אם תרצה, בצע ניתוח נוסף ושחזורים תלת-ממדיים באמצעות ההוראות בכתב היד של הטקסט.
כדי לבצע ניתוח תלת-ממדי של עוברים מפותחים יותר, לנתח עוברים עובריים 18.5 עוברים ב- PBS קר, להסיר את כל הממברנות העובריות הנוספות, ולאחר מכן לשטוף את העוברים מספר פעמים PBS טרי כדי להסיר דם ופסולת המיוצרים במהלך הליך הנתיחה. לתקן עוברים ב 4%PFA עשה PBS בארבע מעלות צלזיוס במשך חמישה עד שבעה ימים. לאחר שטיפת העובר מספר פעמים ב- PBS, לייבש את העוברים על ידי דגירה ב 10%10 עליות רצופות של פתרונות מתנול עד 100% מתנול הוא הגיע.
בצע כל דגירה במשך 25 דקות על שייקר בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לדגור עוברים בנפרד על שייקר הראשון ליום אחד ב 5% מי חמצן במתנול ולאחר מכן ב 10% מי חמצן במתנול עד שלושה ימים עד העוברים לאבד את כל פיגמנטציה טבעית. בהדרגה rehydrate העוברים בסדרת מתנול הפוכה במים demineralized עם כל דגירה במשך 20 דקות על שייקר בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף את העוברים שלוש פעמים במשך 30 דקות לכל לשטוף במים demineralized.
כדי להטמיע עוברים בבלוקים של 1%agarose, מלא צינור פלסטיק 50 מיליליטר או מזרק עם אגרווז מומס, ולאחר מכן למקם את העובר באגרוז במצב אנכי ולשמור על עמדה זו עם מלקחיים במהלך התגבשות של האגרוז. מניחים את התבנית עם הבלוק על ארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עבור agarose כדי להתגמש במלואו, ולאחר מכן להסיר את בלוק agarose עם העובר מן התבנית ומניחים אותו במיכל עם מים מיואשים. בצע התייבשות העובר בהדרגה עם 10% עליות בריכוז מתנול מדולל במים demineralized או PBS, שמירה על המדגם בריכוז מתנול לפחות 45 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר עד 100% מתנול הוא הגיע.
לנקות את העוברים על ידי העברתם דרך פתרון BABB סדרה מתנול במשך 2.5 שעות בכל ריכוז עם 25% עליות בריכוז BABB עד שהגיע 100% BABB. החליפו את תמיסת BABB בתמיסה טרייה מדי יום עד שהעובר יהיה שקוף לחלוטין. תהליך זה עשוי להימשך שלושה עד חמישה ימים.
השתמש בדבק כדי לצרף את בלוק האגרוז המנוקה לציר המנוע של סורק OPT, ולאחר מכן התאם את האופטיקה כדי לקבל תמונה של העובר כולו ולהמשיך לרכוש ערכת נתוני הקרנה מלאה. טכניקת ההדמיה החיה 4D מאפשרת ניתוח דינמי של ביטוי כתב LuVeLu ועוברי יום עוברי 8.5 Snai1-מותנה נוקאאוט עוברי. יחד עם האות הרגיל LuVeLu על mesoderm presomitic, עוברי נוקאאוט מותנה Snai1 מציגים ביטוי LuVeLu בבליטה חוץ רחמית הנובעת מהפס הפרימיטיבי.
בדיקות אימונופלואורסצנטיות בהר שלם מאפשרות זיהוי של NMPs פוטנציאליים ורגולטורים מרכזיים של בידול mesoderm. חצים לבנים וצהובים מדגישים הבדלים בעוברים המוטנטים והפראיים. עיבוד תלת מימדי של חיסוני הר שלם מאפשר הבנה טובה יותר של הרקמה או המבנה במחקר.
במקרה זה, המיקום של NMPs פוטנציאליים ב bud tail ניצן נחקר. שחזורי רקמות תלת-ממדיים חשובים גם כדי להבין ולאפיין פגמים מורפולוגיים בעוברי עכבר. ויזואליזציה אינטראקטיבית של שחזור תלת-ממד יכולה להיבנות גם בפורמטים ידידותיים למשתמש.
לדוגמה, בקובץ PDF. מבנים עובריים תלת-ממדיים אלה יכולים לשמש כדי להמחיש את העוצמה של מודלים תלת-ממדיים לקהל כללי יותר ולעזור במחקר בהוראת התארכות צירית של בעלי חוליות וסגמנטציה. לבסוף, 3D בהדמיית טוטו של עוברי עכבר מפותחים יותר אפשרי באמצעות טכניקת מיקרוסקופיה OTP.
עיבודים מונפשים מוצגים כאן, המדגישים פרוסות מפתח של עוברים ביום העוברי 18.5. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא כי התוצאה חייבת להישאר ייצוג נאמן של מה שנצפה בעובר. חוקרים יכולים להשתמש בשיטות אלה כדי ללכת מעבר להצגת רק סטטי לתמונות, אבל גם לכלול קטעי וידאו, שחזורים תלת ממדיים, ואפילו מודלים תלת-ממדיים אינטראקטיביים של הנתונים שלהם.
