Стадии органогенеза у эмбрионов мышей остаются малоизученными отчасти из-за сложной визуализации сложных структур эмбриона. Этот протокол описывает методы, которые позволяют 3D и 4D визуализацию и анализ эмбрионов мыши во время осевого расширения и сегментации. Основным преимуществом данной методики является то, что она позволяет исследователям изучать и показывать сложные структуры эмбриона мыши в виде 3D динамических объектов.
Этот протокол содержит методы, которые могут быть использованы при изучении врожденных пороков развития, затрагивающих позвонок и спинной мозг млекопитающих, таких как сколиоз. Эти методы также могут быть использованы с модельными системами in vitro, что позволяет изучать эмбриональное развитие человека. Чтобы подготовить эмбрионы мышей между эмбриональным днем 8,25 и эмбриональным днем 10,5 для живой визуализации, рассекните эмбрионы в предварительно подогретой среде M2 при 37 градусах Цельсия.
Аккуратно удалите желточный мешок с помощью чистых щипцов и вымойте эмбрион один раз свежей средой M2, чтобы удалить кровь и мусор, образующиеся во время рассечения. Во время процедуры визуализации в реальном времени инкубируют эмбрионы в среде DMEM с низким содержанием глюкозы, дополненной 10% определяемым HyClone FBS, двумя миллимолярами L-глутамина и 1% пенициллиновым стрептомицином в камере с подогревом 37 градусов Цельсия и 65% кислородом с 5% углекислого газа. Чтобы подготовить эмбрионы мышей аналогичной стадии к иммунофлуоресцентной микроскопии, вместо использования нагретого М2 рассекают эмбрионы в холодном PBS и фиксируют в 4% параформальдегиде.
После выполнения всего протокола окрашивания иммунофлуоресценции mount, как описано в тексте рукописи, очистка тканей может быть достигнута с помощью RapiClear. Сначала поместите эмбрионы в центр вогнутого стеклянного предметного стекла с депрессией 75 на 25 миллиметров, удалите весь PBST в микроскопе и добавьте 200 микролитров очищающего раствора, затем накройте подготовку слайда коробкой. Через 10 минут, защищенных от света, когда эмбрионы начнут становиться прозрачными, замените очищающий раствор и подождите еще 20 минут.
Сверху на зародыш взмах, начиная с одной стороны и осторожно двигаясь в сторону другой. Теперь образец готов к визуализации. Для очистки с использованием метилсалицилата или BABB убедитесь, что эмбрионы полностью обезвожены в 100% метаноле, а затем начните серию BABB и метанола с 20% последовательным увеличением концентрации и 20-минутной инкубацией для каждой стадии.
Когда раствор BABB достигнет 100%, внесите два дополнительных изменения для свежего раствора. Подготовьте стеклянный слайд размером 20 на 60 миллиметров 1,5 для крепления эмбрионов, чтобы избежать сжатия образца. Добавьте распорки из тонких металлических шайб.
Перенесите очищенные эмбрионы на предметные стекла микроскопа с помощью зубочистки, тонкого хлопкового наконечника или пипетки Пастера. Затем добавьте каплю монтажной среды, накройте другим аналогичным покровным стеклом и запечатайте расплавленным парафином, чтобы лучше стабилизировать препарат, чтобы избежать пузырьков. Поместите крышку на одну сторону, а затем постепенно и осторожно сдвиньте ее в сторону, добавив больше среды, если это необходимо.
Теперь образец готов к получению изображения в микроскоп. Используйте Fiji/ImageJ для репозиции эмбриона в стандартизированное положение передне-задней и дорсально-вентральной оси после визуализации. Уменьшите размер набора данных на изображении Фиджи, затем масштабируйте и вставьте значения шкалы X, Y и Z, необходимые для уменьшения набора данных до менее 200 мегабайт.
Убедитесь, что отмечен флажок Создать новое окно. Затем перейдите в плагины и откройте 3D Viewer. В окне 3D Viewer нажмите на эмбрион, чтобы выбрать его, в результате чего появится красное 3D-поле.
При использовании этого режима управляйте поворотом набора данных с помощью мыши. После обеспечения идеального положения эмбриона выберите редактирование, преобразование изображения и экспорт преобразованного изображения в окне 3D Viewer. Осмотрите различные ортогональные плоскости, затем перейдите к изображению, затем сложите и выберите ортогональные виды.
Когда эмбрион правильно позиционируется, выберите меню окна 3D Viewer, затем отредактируйте, преобразуйте и сохраните матрицу преобразования в текстовый файл с расширением мата. Откройте текстовый файл с помощью Fiji/ImageJ, удалите первые две строки и повторно сохраните. При этом создается файл матрицы преобразования, совместимый с подключаемым модулем TransformJ.
Переключитесь на полный набор данных разрешения и выполните операцию плагинов TransformJ и TransformJ affine. В новом окне найдите ранее сохраненный файл матрицы, выберите кубическую интерполяцию B-сплайн и ресамплинг изотропно, затем нажмите кнопку «ОК». После правильного перемещения эмбриона обрежьте большую часть созданного пустого пространства. Чтобы выполнить полное Z-проекционное изображение, нажмите на стеки, Z Project и выберите максимальную интенсивность.
Затем нарисуйте минимальную рентабельность инвестиций, содержащую весь эмбрион в X и Y.Переключитесь на окна исходного набора данных, щелкнув редактировать, выделять, восстанавливать выделение и обрезать, выбирая изображение. Обрежьте фрагменты в начале и конце, которые не пересекаются с эмбриональными тканями, выбрав изображение и открыв стеки, нажмите на инструменты, выберите средство для удаления фрагментов и укажите первый и последний фрагмент для удаления, обязательно изменив приращение на один. При желании выполните дальнейший анализ и 3D-реконструкции, используя инструкцию в текстовой рукописи.
Чтобы выполнить 3D-анализ более развитых эмбрионов, рассекайте эмбриональные плоды 18,5-го дня в холодном PBS, удалите все лишние эмбриональные мембраны, затем несколько раз промойте плоды в свежем PBS для удаления крови и мусора, образующихся во время процедуры рассечения. Фиксируйте плоды в 4% PFA, сделанные в PBS при четырех градусах Цельсия в течение пяти-семи дней. После промывания эмбриона несколько раз в PBS обезвоживают плод путем инкубации в 10%10 последовательных увеличений растворов метанола до достижения 100% метанола.
Выполняйте каждую инкубацию в течение 25 минут на шейкере при комнатной температуре. Затем инкубируют плоды отдельно на шейкере сначала в течение одного дня в 5% перекиси водорода в метаноле, а затем в 10% перекиси водорода в метаноле в течение трех дней, пока эмбрионы не потеряют всю естественную пигментацию. Постепенно регидратируйте эмбрионы в обратном метанольном ряду в деминерализованной воде с каждой инкубацией в течение 20 минут на шейкере комнатной температуры, затем промывайте эмбрионы три раза в течение 30 минут за одну промывку в деминерализованной воде.
Чтобы встроить плод в 1%-агарозные блоки, заполните 50-миллилитровую пластиковую трубку или шприц расплавленной агарозой, затем поместите плод в агарозу в вертикальное положение и поддерживайте это положение щипцами во время затвердевания агарозы. Поместите форму с блоком при четырех градусах Цельсия на 30 минут, чтобы агароза полностью желеобразилась, затем удалите блок агарозы с плодом из формы и поместите его в емкость с деморализованной водой. Осуществляют обезвоживание плода постепенно с 10%-ным увеличением концентрации метанола, разбавленного в деминерализованной воде или PBS, сохраняя образец в концентрации метанола в течение не менее 45 минут при комнатной температуре на шейкере до тех пор, пока не будет достигнуто 100% метанола.
Очищают плоды, перемещая их через последовательный раствор BABB и метанол в течение 2,5 часов в каждой концентрации с 25%-ным увеличением концентрации BABB до достижения 100% BABB. Заменяйте раствор BABB на свежий каждый день, пока плод не станет полностью прозрачным. Этот процесс может занять от трех до пяти дней.
Используйте клей для прикрепления очищенного блока агарозы к моторной оси сканера OPT, затем отрегулируйте оптику для получения изображения всего плода и приступайте к получению полного набора данных проекции. Метод 4D-визуализации в реальном времени позволяет динамически анализировать экспрессию репортера LuVeLu и эмбриональные эмбрионы Snai1-условного нокаута 8.5. Наряду с нормальным сигналом LuVeLu на пресомитической мезодерме, Snai1-условные нокаутирующие эмбрионы демонстрируют экспрессию LuVeLu в эктопической выпуклости, которая возникает из примитивной полосы.
Иммунофлуоресцентные анализы с цельным креплением позволяют обнаружить потенциальные НМП и ключевые регуляторы дифференцировки мезодермы. Белые и желтые стрелки подчеркивают различия в эмбрионах мутантного и дикого типа. 3D-рендеризация целых иммуноокрашений позволяет лучше понять ткань или структуру в исследовании.
При этом было исследовано расположение потенциальных НМП в хвостовой почке. 3D-реконструкции тканей также важны для понимания и характеристики морфологических дефектов у эмбрионов мышей. Интерактивная визуализация 3D-реконструкции также может быть построена в удобных для пользователя форматах.
Например, в PDF-файле. Эти 3D-каудальные структуры эмбриона могут быть использованы для иллюстрации силы 3D-моделей для более широкой аудитории и для помощи в исследовании в обучении осевому удлинению и сегментации позвоночных. Наконец, 3D-визуализация более развитых эмбрионов мышей возможна с использованием метода OTP-микроскопии.
Здесь показаны анимированные рендеры, выделяющие ключевые срезы эмбрионального дня 18,5 плодов. Самое главное, что нужно помнить, это то, что результат должен оставаться верным представлением того, что наблюдается у эмбриона. Исследователи могут использовать эти методы, чтобы выйти за рамки представления только статических изображений, но также включить видео, трехмерные реконструкции и даже интерактивные 3D-модели своих данных.
