Este protocolo proporciona un método de sobremesa para evaluar la eficacia y los mecanismos de acción de la terapia trombolítica asistida por histotricia o lisotricia, un enfoque alternativo no invasivo para tratar la trombosis venosa profunda crítica. Esta técnica utiliza la actividad de las burbujas para tener un efecto bidireccional a través de un aumento de la fibrinólisis debido a una entrega lítica mejorada y la hemólisis de los glóbulos rojos dentro del coágulo. Este enfoque de sobremesa para tratar la trombosis venosa profunda facilita el modelado de coágulos sanguíneos, el tratamiento con lisotricia y las imágenes simultáneas durante el tratamiento.
La generación de nubes de burbujas, la planificación del tratamiento y la guía de imágenes se pueden utilizar para investigar los tratamientos in vitro basados en la histotricia de otras enfermedades, como los tumores renales y hepáticos. Para configurar la fuente de histotricia, monte la fuente en un sistema de posicionamiento motorizado. Cubra la matriz de imágenes con una cubierta de sonda y fije la matriz coaxialmente en la abertura de la fuente de histotricia.
Conecte la matriz de imágenes a un sistema de escaneo de ultrasonido y sumerja completamente la fuente de histotricia y la matriz de imágenes en el tanque. Use una jeringa para eliminar suavemente cualquier burbuja de aire y use la matriz de imágenes y el escáner para adquirir imágenes de agua desgasificación en modo B a 20 cuadros por segundo. Al adquirir las imágenes, ajuste la posición de la matriz de imágenes dentro de la abertura del transductor confocal hasta que la nube de burbujas se encuentre aproximadamente en el centro de la ventana de la imagen y registre la ubicación focal detectada en la ventana de imágenes.
Luego suspenda la insonación y ajuste el voltaje aplicado a la fuente de histotricia a cero. Para preparar un coágulo para el análisis, use alicates para cortar el extremo sellado de una pipeta que contiene un coágulo y deje que el coágulo y el suero se deslicen en una placa de Petri. Use un bisturí para cortar el coágulo a un centímetro de longitud y use una toallita de limpieza para secar suavemente la sección cortada para eliminar el exceso de líquido.
Use pinzas para colocar cuidadosamente la sección de coágulo en una báscula y registre el peso. A continuación, levante manualmente el canal de flujo de un tanque de agua de ósmosis inversa desgasificada y retire el recipiente modelo del canal. Use pinzas para colocar cuidadosamente el coágulo en el recipiente modelo sin dañar el coágulo y conecte el recipiente al canal de flujo.
Baje el canal de flujo en el tanque de tal manera que el extremo proximal de la etapa en relación con el reservorio sea bajo en comparación con el lado distal, y use una pipeta para agregar 30 microlitros de plasma calentado a 37 grados Celsius al reservorio. Controle la temperatura del tanque de agua hasta que alcance al menos 36 grados centígrados y use una pipeta para agregar 80.4 microgramos de rt-PA al depósito de plasma. Para cebar el canal de flujo, use una bomba de jeringa para extraer plasma del depósito hacia el canal hasta que se haya llenado el recipiente modelo.
Luego, nivele manualmente el recipiente modelo para asegurarse de que no haya burbujas de aire presentes en el recipiente modelo, como se ve dentro de la ventana de imágenes. Para planificar una ruta para la fuente de histotricia y la matriz de imágenes para una exposición uniforme a la histotricia a lo largo de la longitud del coágulo, use el guión de imágenes para usar los posicionadores motorizados para alinear la matriz de imágenes paralela a la longitud del coágulo y confirmar que no hay burbujas de aire presentes en el vaso. Utilice los posicionadores motorizados para alinear la matriz de imágenes de tal manera que el plano de la imagen sea paralelo a la sección transversal del coágulo.
Usando la ventana de imágenes como guía, mueva la fuente de histotricia al extremo proximal del coágulo, en relación con el reservorio. Para determinar la trayectoria de insonación a lo largo de la longitud del coágulo, establezca puntos de referencia a lo largo de la longitud del coágulo en incrementos de cinco milímetros. Antes de finalizar cada waypoint, pruebe pulsos de fuego de la fuente de histotricia con los mismos parámetros de insonación que se demostraron, pero con la exposición general reducida a 10 pulsos totales.
En cada waypoint, guarde las posiciones del motor utilizando los comandos designados por el fabricante. Para tratar el coágulo a lo largo de su longitud de acuerdo con la ruta definida en el paso previo al tratamiento, configure la bomba de la jeringa a 0,65 mililitros por minuto y espere a que el menisco del plasma se mueva. Interpole la ruta de tratamiento con pasos intermedios entre los puntos de referencia establecidos con un tamaño de paso fijo y use los posicionadores para mover la fuente de histotricia en cada ubicación de la ruta, utilizando los parámetros de insonación establecidos originalmente.
A continuación, cree un script para configurar la matriz de imágenes para adquirir una imagen en modo B del coágulo y modelar el vaso unos segundos antes de la aplicación del pulso de histotricia en cada ubicación. A continuación, aplicar el pulso de histotricia en cada waypoint, adquiriendo las emisiones acústicas en el guión para formar imágenes de cavitación pasiva tras el análisis. Utilice la ventana de imágenes para obtener imágenes de la actividad de la burbuja durante la aplicación del pulso de histotricia en cada ubicación de la ruta.
Después del análisis, levante manualmente el recipiente modelo fuera del tanque de agua para drenar el perfusato por gravedad, y use la bomba de jeringa para extraer la solución de plasma del canal de flujo para permitir la recolección de todo el perfusato en un vaso de precipitados pequeño. Desconecte el vaso modelo y retire el coágulo. Luego limpie el coágulo con tejidos de laboratorio y pese el coágulo para evaluar la pérdida de masa del coágulo.
Tras la aplicación de suficiente voltaje a la fuente de histotricia, se genera una nube de burbujas en la región focal del transductor y se visualiza a través de imágenes de ultrasonido. La posición focal se define como el centro de la nube de burbujas. Este perfusato de control de un coágulo expuesto solo al plasma, y este perfusato de un coágulo tratado con lisotricia se utilizaron para evaluar el contenido de hemoglobina y dímero D como se demostró.
La variabilidad en la concentración de hemoglobina se puede cuantificar mediante absorbancia óptica. Aquí, un coágulo se puede visualizar dentro de un vaso modelo a través de imágenes en modo B antes de la exposición a la histotricia para determinar la posición del coágulo para la segmentación de la imagen de cavitación pasiva. Como confirma esta imagen de cavitación pasiva co-registrada con la imagen en modo B del coágulo, la energía acústica está contenida principalmente dentro del coágulo durante la exposición a la histotricia.
En las muestras expuestas a histotricia, la interrupción se restringe principalmente al centro del coágulo, de acuerdo con las ubicaciones observadas de la actividad de la burbuja rastreada a través de imágenes de cavitación pasiva. Con la adición de lítico, la pérdida de masa también ocurre en regiones más cercanas a la periferia del coágulo. Alternativamente, los liposomas ecogénicos que contienen rt-PA se pueden utilizar en lugar de la administración sistémica de rt-PA para permitir la evaluación de la administración dirigida de fármacos al coágulo.
La lisotricia proporciona un enfoque alternativo no invasivo para el tratamiento de muchas enfermedades. Este protocolo in vitro permite evaluar la eficacia del tratamiento y su potencial éxito in vivo.
