Describimos un protocolo para la microdisección y posterior aislamiento de microfagos residentes cardíacos mediante la clasificación celular activada por fluorescencia específicamente a partir de los senos paranasales y el nodo AV en el ratón. Con la microdisección precisa del seno y el nodo V, seguida de la combinación de clasificación celular magnética y activada por fluorescencia, podemos aislar específicamente los macrófagos residentes del seno y el nodo V con alta pureza. La identificación y el aislamiento de macrófagos residentes cardíacos de distintas regiones del corazón permite estudiar más a fondo su fenotipo y su impacto específico de la región en la electrofisiología cardíaca.
Después de aislar el corazón, realice los procedimientos de microdisección en una placa de disección con PBS helado de una sola vez bajo un microscopio de disección. Use puntos de referencia anatómicos cardíacos como la aorta, la arteria pulmonar, el seno coronario y el ventrículo izquierdo o derecho para determinar la izquierda-derecha y la parte anterior-posterior del corazón. Después de determinar la orientación, coloque el corazón con la parte delantera en la parte inferior del plato para exponer las venas grandes posteriores.
Corte a lo largo del surco entre los ventrículos y las aurículas para extirpar la mayoría de los ventrículos. Mantenga la parte auricular. Fije el corazón a la placa de disección insertando alfileres a través de la parte restante de la pared libre de LV y el LAA.
Corte la pared libre de RV restante hacia arriba a través de la válvula tricúspide y la vena cava superior. Voltee la AR y la RV y fije la RAA para exponer la región intercava de la cavidad de la AR y el tabique auricular. Para la microdisección de la RAS, corte el corazón a lo largo del tabique interauricular paralelo a la crista terminal para separar la región intercava y obtener la muestra SAN.
Coloque la muestra en un tubo de microcentrífuga vacío de 1,5 mililitros sobre hielo. Para la microdisección de AVN, fije las partes restantes del corazón a través del tejido adyacente al tabique interauricular y al tabique interventricular para mirar hacia el lado auricular derecho del tabique interauricular hacia arriba. Mire la aurícula derecha en la superficie endocárdica para el triángulo de Koch que estará bordeado anteriormente por la línea de bisagra de la valva septal de la válvula tricúspide y posteriormente por el tendón de Todaro.
El orificio del seno coronario se observa en la base. Picar el tejido SAN y AVN con bisturís. Luego agregue 500 microlitros de tampón de digestión recién preparado a cada muestra y lave todo el tejido picado de la pared del tubo de microcentrífuga.
Pipetear suavemente para ayudar a digerir la muestra y homogeneizar el tejido en una máquina de vórtice. Después de la digestión, transfiera la suspensión de tejido a un tubo centrífugo fresco de 15 mililitros pasándolo a través de un filtro celular de 40 micrómetros. Enjuague el colador celular con cinco mililitros adicionales de tampón de clasificación celular para detener la digestión.
Retire el sobrenadante. Después de resuspender el pellet celular con 90 microlitros de tampón de clasificación celular, agregue 10 microlitros de microperlas CD45 por 10 millones de células totales a la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Mezclar bien las muestras.
Durante el tiempo de incubación de la suspensión celular con microperlas y mezcla de anticuerpos, prepare el conjunto de separación magnética conectando la columna magnética a un separador magnético adecuado y luego colocando un tubo de recolección debajo de la columna magnética. Prepare las columnas magnéticas enjuagando con 500 microlitros de tampón de clasificación celular agregado en la parte superior de la columna y permitiendo que el tampón pase. Aplique la suspensión celular inmediatamente sobre la columna, evitando burbujas de aire, mientras pasa el tampón de clasificación celular.
Lave la columna tres veces con 500 microlitros de tampón de clasificación celular. Agregue un mililitro de búfer de clasificación celular a la columna. Retire la columna del separador magnético y colóquela en un nuevo tubo de recolección.
Enjuague inmediatamente la columna aplicando firmemente el émbolo suministrado con la columna para obtener el flujo que contiene las celdas marcadas magnéticamente. Después de aplicar la muestra no teñida y los tubos de compensación, ajuste los voltajes de cada canal para alinear los picos positivos y negativos a la posición correcta del eje. Establezca la estrategia de acceso como se describe en el manuscrito de texto utilizando DAPI como marcador de viabilidad.
Verifique los diagramas de citometría de flujo para confirmar que la población celular de interés se muestra correctamente en los gráficos. Recopile las células clasificadas en medio o tampón según la necesidad de experimentos posteriores. Para confirmar una disección correcta, la identificación de la RAS y AVN se realizó mediante inmunofluorescencia y tinción tricrómica de Masson.
Aquí se muestra la tinción inmunofluorescente de las células del sistema de conducción positiva HCN4 en el SAN y AVN, así como la tinción tricrómica de Masson de SAN y AVN. La estrategia de compuerta para la clasificación celular de macrófagos cardíacos residentes ayudó a identificar células mononucleares mediante la exclusión de dobletes en el área de dispersión hacia adelante del eje y frente a la del eje x. Las células muertas fueron excluidas por DAPI.
Las células vivas fueron cerradas para leucocitos CD45 positivos, luego para células mieloides CD11b positivas. Los macrófagos cardíacos se identificaron mediante la expresión de F4/80 y CD64, luego se estratificaron mediante la expresión del antígeno linfocítico seis. Se observaron células recién clasificadas bajo microscopía de campo claro.
Las células fueron positivas para CD45 cuando se observaron bajo el canal de PE fluoróforo. Cuando se observó bajo el fluoróforo APC tamaño siete canales, la misma vista de las células clasificadas mostró células CD11b positivas. Se utilizó el fluoróforo PE tamaño siete canales para identificar el fenotipo positivo F4/80.
Y las células triple positivas se identificaron como macrófagos residentes cardíacos. Los macrófagos cardíacos aislados cultivados en medio durante un máximo de seis días se indican con flechas blancas, mientras que las flechas negras indican células muertas. Los macrófagos ordenados se pueden utilizar para otros estudios funcionales, como experimentos de pinza de parche o estudios de expresión, como secuenciación de ARN o estudios proteómicos.
