Descrevemos um protocolo para microdissecção e subsequente isolamento de micrófagos residentes cardíacos por triagem celular ativada por fluorescência especificamente do seio e do nó AV no camundongo. Com a microdissecção precisa do seio e do nó V, seguida pela combinação de classificação celular magnética e ativada por fluorescência, somos capazes de isolar especificamente macrófagos residentes do seio e do nó V em alta pureza. A identificação e o isolamento de macrófagos residentes cardíacos de regiões distintas do coração permitem estudar melhor seu fenótipo e seu impacto específico da região na eletrofisiologia cardíaca.
Depois de isolar o coração, execute os procedimentos de microdissecção em um prato de dissecação com PBS gelado de uma só vez sob um microscópio de dissecação. Use marcos anatômicos cardíacos, como aorta, artéria pulmonar, seio coronariano e ventrículo esquerdo ou direito para determinar a esquerda-direita e anteroposterior do coração. Depois que a orientação for determinada, posicione o coração com a frente na parte inferior do prato para expor as veias grandes posteriores.
Corte ao longo do sulco entre os ventrículos e os átrios para remover a maioria dos ventrículos. Mantenha a parte atrial. Fixe o coração ao prato de dissecação inserindo pinos através da parte restante da parede livre de VE e do LAA.
Corte a parede livre do VD restante para cima através da valva tricúspide e da veia cava superior. Vire a AR e o VD para longe e fixe o ARA para expor a região intercaval da cavidade da AR e o septo atrial. Para a microdissecção de SAN, corte o coração ao longo do septo interatrial paralelo à crista terminal para separar a região intercaval para obter a amostra de SAN.
Coloque a amostra em um tubo de microcentrífuga vazio de 1,5 mililitro no gelo. Para a microdissecção da AVN, fixe as partes restantes do coração através do tecido adjacente ao septo interatrial e ao septo interventricular para enfrentar o lado atrial direito do septo interatrial. Olhe para o átrio direito na superfície endocárdica para o triângulo de Koch, que será delimitado anteriormente pela linha da dobradiça do folheto septal da válvula tricúspide e posteriormente pelo tendão de Todaro.
O orifício do seio coronário é observado na base. Pique o tecido SAN e AVN com bisturis. Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão de digestão recém-preparado a cada amostra e lave todo o tecido picado da parede do tubo de microcentrífuga.
Pipeta suave para ajudar a digerir a amostra e homogeneizar o tecido em uma máquina de vórtice. Após a digestão, transfira a suspensão do tecido para um tubo de centrífuga fresco de 15 mililitros, passando-o através de um filtro de células de 40 micrômetros. Lave o filtro celular com mais cinco mililitros de tampão de classificação celular para parar a digestão.
Remova o sobrenadante. Depois de ressuspender o pellet celular com 90 microlitros de tampão de classificação celular, adicione 10 microlitros de microesferas CD45 por 10 milhões de células totais à suspensão celular em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Misture bem as amostras.
Durante o tempo de incubação da suspensão celular com microesferas e mistura de anticorpos, prepare o conjunto de separação magnética anexando a coluna magnética a um separador magnético adequado e, em seguida, colocando um tubo de coleta sob a coluna magnética. Prepare colunas magnéticas enxaguando com 500 microlitros de buffer de classificação celular adicionado na parte superior da coluna e permitindo que o buffer passe. Aplique a suspensão celular imediatamente sobre a coluna, evitando bolhas de ar, enquanto o buffer de classificação de células está passando.
Lave a coluna três vezes com 500 microlitros de tampão de classificação celular. Adicione um mililitro de buffer de classificação de células à coluna. Remova a coluna do separador magnético e coloque-a em um novo tubo de coleta.
Lavar imediatamente a coluna aplicando firmemente o êmbolo fornecido com a coluna para obter o fluxo que contém as células marcadas magneticamente. Depois de aplicar a amostra não corada e os tubos de compensação, ajuste as tensões de cada canal para alinhar os picos positivo e negativo à posição adequada do eixo. Defina a estratégia de gating conforme descrito no manuscrito do texto usando DAPI como um marcador de viabilidade.
Verifique os gráficos de citometria de fluxo para confirmar que a população celular de interesse é mostrada corretamente nos gráficos. Colete as células classificadas em meio ou buffer com base na necessidade de experimentos subsequentes. Para confirmar a dissecção correta, a identificação da SAN e da AVN foi feita por meio da coloração imunofluorescente e tricrômica de Masson.
A coloração imunofluorescente de células do sistema de condução HCN4 positivas na SAN e AVN, bem como a coloração tricrômica de SAN e AVN de Masson são mostradas aqui. A estratégia de gating para triagem celular de macrófagos cardíacos residentes ajudou a identificar células mononucleares pela exclusão de duplos na área de dispersão para frente do eixo y versus a do eixo x. As células mortas foram excluídas pelo DAPI.
As células vivas foram dependentes de leucócitos CD45 positivos e, em seguida, de células mieloides CD11b positivas. Os macrófagos cardíacos foram identificados pela expressão de F4/80 e CD64, estratificados pela expressão do antígeno linfocitário seis. Células recém-classificadas foram observadas sob microscopia de campo brilhante.
As células foram positivas para CD45 quando observadas sob o canal de fluoróforo PE. Quando observado sob fluoróforo APC tamanho sete canal, a mesma visão das células classificadas mostrou células CD11b positivas. O fluoróforo de PE tamanho sete canais foi utilizado para identificar o fenótipo F4/80 positivo.
E as células triplas positivas foram identificadas como macrófagos residentes cardíacos. Macrófagos cardíacos isolados cultivados em meio por até seis dias são indicados com setas brancas, enquanto as setas pretas indicam células mortas. Os macrófagos classificados podem ser usados para estudos funcionais adicionais, como experimentos de patch clamp ou estudos de expressão, como sequenciamento de RNA ou estudos proteômicos.
